馬進+向極釬+楊永康+龍瀾+李紅英+覃大吉+李亞杰+向來

摘要：青蒿素及其衍生物被世界衛(wèi)生組織和FDA列為抗瘧疾一線藥，而目前青蒿素只能從黃花蒿（Artemisia annua L.）中提取。育成的高含量青蒿素單株其優(yōu)良性狀不能穩(wěn)定遺傳，后代性狀分離，表現(xiàn)多樣化。介紹了國內外對黃花蒿品種的選育途徑及現(xiàn)狀。通過2010-2013年4年系統(tǒng)選育，已育成一批好苗頭株系，株系群體青蒿素含量由選育前平均含量0.471%提高到0.800%～0.972%，生物學特征特性也趨于穩(wěn)定一致，并在黃花蒿原料基地小面積示范得到驗證，同時選育出青蒿素高含量株系40#-30-08-18，青蒿素含量高達1.945%，取得了階段性育種成果。

關鍵詞：黃花蒿（Artemisia annua L.）；青蒿素；育種現(xiàn)狀；目標性狀；系統(tǒng)選育

中圖分類號：S567.21；S333.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4520-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.003

Current Situation of Breeding and Progress of Systematic Breeding of

New Varieties of Artemisia annua

MA Jin1，2，3， XIANG Ji-qian1，2， YANG Yong-kang2，3， LONG Lan2，3， LI Hong-ying2，3，

QIN Da-ji2，3， LI Ya-jie2，3， XIANG Lai4

（1.Hubei Provincial Agricultural Science and Technology Innovation Center，Enshi 445000， Hubei， China； 2. Institute of Horticulture and Drugs， Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences Enshi 445000， Hubei， China； 3.Enshi Qingjiang Biological Engineering Co.， Ltd.，Enshi 445000， Hubei， China； 4.Enshi City Sancha Township Agricultural Center，Enshi 445019， Hubei， China）

Abstract： Artemisinin and its derivatives are designated by WHO and FDA as the first line and effective drug for treating malaria， while they can only be extracted from Artemisia annua currently. The excellent characters of Artemisia annua plants selected with high levels of artemisinin can not inherit stably. The properties of offspring separate with diverdity. The current situation of breeding of Artemisia annua at home and abroad was briefly described. Authors got some breeding lines by pedigree selection from 2010 to 2013. The average artemisinin content of the breeding lines increased from 0.471% to 0.800%～0.972%. The biological characteristics were tended to be stable and consistent. The artemisinin content of one breeding line 40#-30-08-18 was high upto 1.945%.

Key words：Artemisia annua L.； artemisinin； breeding status； target trait； system selection

瘧疾嚴重影響人類健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全球有107個國家和地區(qū)、32億人口受到瘧疾傳播的威脅，每年造成超過65萬人死亡，嚴重影響人類健康，發(fā)病區(qū)域主要在非洲、東南亞等國家。20世紀70年代我國科技工作者首次從黃花蒿中分離出抗瘧疾單體青蒿素，為抗瘧疾特效藥。從20世紀80年代中期起，研究者們對青蒿素的結構進行研究并加以改造，先后成功合成青蒿素的衍生物：青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素3個新藥，它們的抗瘧藥效要遠遠優(yōu)于以往抗瘧藥奎寧、氯喹等傳統(tǒng)抗瘧藥而躍升為未來的主流藥物，同時對血吸蟲病、艾滋病并發(fā)癥等也有很好的療效。它是迄今為止中國惟一被世界衛(wèi)生組織（WHO）認可的按西藥標準開發(fā)的中藥，是中國僅有兩個收入世界藥典的中藥之一，被世界衛(wèi)生組織指定為“世界上惟一有效的瘧疾治療藥物”[1]。

1 黃花蒿概述

黃花蒿（Artemisia annua L.）又名臭蒿，臭青蒿，草蒿子，為菊科（Asteraceae）蒿屬（Artemisia）一年生草本植物。黃花蒿系世界性廣布種，從中提取的青蒿素是一種含有過氧化橋的倍半菇內酷，無色針狀晶體，熔點156～157 ℃，分子式C12H22O5，是一種與已知抗瘧藥完全不同類型的新型化合物。但其青蒿素含量隨產(chǎn)地不同差異極大，除我國少數(shù)地區(qū)的黃花蒿外，世界大多數(shù)地區(qū)的黃花蒿的青蒿素含量都很低，一般為0.200%以下[2]。在我國，黃花蒿的青蒿素含量由南到北逐漸降低。例如，廣西、廈門、四川酉陽、湖南、湖北、江蘇高郵、山東、陜西、內蒙古的黃花蒿的青蒿素含量分別達1.200%、1.200%、0.980%、0.790%、0.680%、0.190%、0.097%、0.215%、0.170%[2-9]，尤其是生長在川東南、鄂西、湘西及黔東北武陵山區(qū)的黃花蒿的青蒿素含量普遍較高[2]。在國外，以越南的黃花蒿的青蒿素含量較高，其葉中青蒿素含量可達0.860%[10]。印度一些地區(qū)的黃花蒿的青蒿素含量在葉中可高達0.420%[11]，其他國家和地區(qū)的黃花蒿的青蒿素含量一般在0.200%。

從天然黃花蒿中提取青蒿素是目前獲取青蒿素的惟一來源。當前栽培的黃花蒿由野生黃花蒿直接引種，產(chǎn)量低，尤其是青蒿素含量低（0.500%以下）。由于遺傳差異，單株之間青蒿素含量差異特別大（0.200%～1.945%）。目前國內大多數(shù)青蒿素生產(chǎn)企業(yè)的青蒿素提取率在0.300%～0.350%，提取率低的主要原因是黃花蒿原料青蒿素含量低（0.500%～0.600%），其次是提取工藝水平落后。2005-2006年青蒿素賣價高達4 500～5 500元/kg，生產(chǎn)企業(yè)利潤非常豐厚，從2007年起行情逐年下滑，至2013年市場價跌至2 000元/kg以下。而在當前勞動力成本急劇上漲的情況下，青蒿素的生產(chǎn)成本在2 600元/kg左右，生產(chǎn)企業(yè)出現(xiàn)嚴重虧損，眾多生產(chǎn)企業(yè)倒閉，給國家及銀行造成巨大經(jīng)濟損失。

現(xiàn)存的青蒿素生產(chǎn)企業(yè)，要想重振昔日雄風，除在現(xiàn)行醫(yī)藥流通環(huán)節(jié)打通癥結外，關鍵是要收購青蒿素含量高的原料和提高青蒿素的提取率，幫助企業(yè)扭虧為盈。據(jù)生產(chǎn)青蒿素的老牌企業(yè)恩施清江生物工程有限公司成本核算，在黃花蒿原料青蒿素含量0.600%和提取工藝及有機溶劑、輔料、勞動力等成本不變的情況下，原料青蒿素含量每提高0.100%將為企業(yè)增收25%以上。

2 黃花蒿的栽培育種研究現(xiàn)狀

黃花蒿生活力強，野生資源豐富，但近年來由于需求量增大，主要依靠人工栽培種植，從20世紀70年代開始，研究者們著手黃花蒿的引種和馴化工作，他們對黃花蒿的生物學特性、栽培條件、生活習性、生長發(fā)育規(guī)律等方面進行了研究，為黃花蒿栽培提供了科學依據(jù)。青蒿素在黃花蒿中儲存部位的研究尚沒有肯定的答案，現(xiàn)在普遍認為黃花蒿葉及花中存在的腺毛狀分泌腺[12]T-型網(wǎng)狀分泌腺[13]是青蒿素合成和儲存的位點。

目前普遍認為黃花蒿是一種嚴格的短日照植物，未成年的植株對光周期信號很敏感，光處理兩周就會開花[14]。黃花蒿抗逆性強[15]，在栽培條件下，只要黃花蒿的基本營養(yǎng)得到滿足，就能正常生長發(fā)育，開花，結子，種子繁殖能力強，栽培植株生長比野生植株好，青蒿素含量也明顯高于當?shù)匾吧N[5，6，16，17]。微量元素硼[18]能提高青蒿素含量，外施生長調節(jié)物質[19]能夠促進植株長高和青蒿素含量提高。而收獲前水脅迫兩周會導致青蒿素含量大幅降低[20]。張萍等[16]認為黃花蒿具有種子馴化現(xiàn)象，經(jīng)過多年種植后，青蒿素含量明顯升高。提前播種移栽能提高產(chǎn)量和青蒿素含量[21，22]。研究者們對青蒿素含量達最高點時黃花蒿的生長時期進行了許多研究，結論不一[14，23]，但均集中在營養(yǎng)生長末期至開花期這段時期，綜合考慮生物量和青蒿素含量，一般的收獲時間是在花芽分化期[5，6，24]。青蒿素含量最高值出現(xiàn)在晴好天氣的12：00-16：00[24，25]。

目前國內還沒有真正意義上的黃花蒿品種[3]，因為育成一個高產(chǎn)、高含量青蒿素單株，其后代的遺傳性狀不穩(wěn)定，性狀分離且表現(xiàn)多樣化。近年來，人們在高含量黃花蒿品種選育上做了一些基礎性工作。①Ferreira等[26]在溫室和田間條件下對青蒿素產(chǎn)生的廣義遺傳性狀進行分析，發(fā)現(xiàn)青蒿素含量的高低是由遺傳性狀決定的。②Wallaart等[27]利用秋水仙素誘導出四倍體黃花蒿，發(fā)現(xiàn)四倍體植株青蒿素含量比二倍體植株高38%，葉片比二倍體大得多，但植株矮小，產(chǎn)量低。③Magalhaes等[28]報道黃花蒿雜交種青蒿素產(chǎn)量可增加5 kg/hm2。④Sangwan等[29]利用分子標記，發(fā)現(xiàn)不同基因型黃花蒿之間存在較高的多態(tài)性，揭示了植株化學物質的差異源于遺傳性狀的多態(tài)性。⑤朱衛(wèi)平[30]對高青蒿素含量黃花蒿栽培品種選育目標性狀進行了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)通過優(yōu)中選優(yōu)的方法可以使青蒿素含量逐年提高；而且研究了葉的形態(tài)與青蒿素含量的相關性，發(fā)現(xiàn)狹裂片型葉比寬裂片型葉的青蒿素含量要高；此外還對黃花蒿葉的結構進行了顯微觀察及青蒿素的組織化學定位，發(fā)現(xiàn)葉片中的毛狀分泌腺是青蒿素的儲存部位，其濃度與含量呈正相關。⑥有研究者利用青蒿素代謝工程育成高含量青蒿素的青蒿品種，并在產(chǎn)業(yè)上有重大突破。

目前，國內外改造黃花蒿的遺傳工作仍然進展緩慢，原因是其代謝復雜，遺傳機制不甚明了。

3 黃花蒿新品種系統(tǒng)選育研究方法及進展

2009年湖北的恩施清江生物工程有限公司與恩施自治州農業(yè)科學院藥物園藝研究所聯(lián)合組織了黃花蒿高產(chǎn)、高青蒿素含量品種選育工作，課題組將釆用系統(tǒng)選育法（優(yōu)中選優(yōu)法）用7～8年時間育成一批單產(chǎn)超3 000 kg/hm2、青蒿素含量大于1.000%且穩(wěn)定的一批株系，用于恩施清江生物工程有限公司基地生產(chǎn)黃花蒿原料。通過2010-2013年4年時間對所栽培的黃花蒿進行系統(tǒng)選育，課題組已育成一批好苗頭株系，植株形態(tài)及特征特性也趨于一致，取得了階段性成果，現(xiàn)報告如下。

3.1 黃花蒿繁殖生物學特征特性

黃花蒿一般采用種子繁殖[31]，種子千粒重為0.03～0.04 g，且種子無休眠期，可隨采隨播，幼苗抗寒性較強，在恩施自治州一般年份都能安全越冬。生長階段：6-7月中旬為營養(yǎng)生長盛期，8月上旬為花芽分化，9月上旬至下旬為現(xiàn)蕾期，9月下旬至10月上旬為開花期，10月上旬至11月上旬為謝花期，11月中旬至12月上旬為種子成熟期。種子成熟期很不一致，光照條件好的先成熟，蔭蔽的下部后成熟。

花為頭狀花序，花序細小球形，具軟細短梗；許多無柄小花密集著生于花序軸的頂部，聚成頭狀，再由許多頭狀花序組成傘房花序?；轱L媒花，異花授粉且自花不實。

3.2 確定選育目標性狀

1）育成的株系植株屬于豐產(chǎn)型，要求莖稈粗壯，株高1.6～2.4 m，一級分枝多，中下部二級分枝多，上部二級分枝少；葉為狹裂絲狀裂片型，莖稈和葉片顏色偏黃。

2）育成的株系青蒿原料單產(chǎn)超3 000 kg/hm2且青蒿素含量穩(wěn)定大于1.000%的一批株系。

3.3 選育步驟及方法

3.3.1 黃花蒿試驗苗定植 2010年4月10日從黃花蒿苗圃中選取長勢旺盛、根系發(fā)達且無病蟲危害的壯苗，按1.0 m×1.5 m的密度定植于恩施市三岔鄉(xiāng)小井口試驗田（海拔842 m），肥水及病蟲防治等田間管理與青蒿原料基地相同。

3.3.2 黃花蒿掛牌、取樣 掛牌的黃花蒿植株必須符合目標性狀，要求莖稈粗壯，株高1.6～2.4 m，一級分枝多，中下部二級分枝多，上部二級分枝少；葉為狹裂絲狀裂片型，莖稈和葉片顏色偏黃。編號采用1#、2#、3#等表示。

先編號掛牌然后取樣，取樣時間定于每年8月10日左右，晴天12：00-16：00（花芽分化期）。方法是取植株上、中、下部枝各一枝裝入網(wǎng)袋中，置于玻璃溫室內干燥，干燥后將葉和幼嫩莖搓成粉末狀裝入塑料自封袋備檢測。

3.3.3 樣品檢測

1）檢測前處理。稱取青蒿樣品2 g，用中性濾紙折疊封嚴浸泡于80 mL 30～60 ℃石油醚中8 h，然后用索氏提取器循環(huán)用石油醚提取4 h（石油醚量不足時應隨時添加保證循環(huán)），加熱浴鍋溫度至52 ℃左右。提取液用旋轉蒸發(fā)器將石油醚分離，然后再用22 mL無水甲醇分3～4次將瓶內提取物借用超聲波振蕩溶解洗出盛入25 mL容量瓶中，并定容至25 mL刻度。滴定管再移取5 mL至50 mL容量瓶中，加0.2%氫氧化鈉溶液20 mL，50 ℃反應30 min，冷卻，加0.08 mol/mL醋酸至50 mL刻度。

2）檢測?；瘜W反應制成溶劑樣品用高效液相色譜儀測出峰面積，計算出青蒿素含量。標樣釆用中國藥檢所制成的青蒿素標樣。

3.3.4 株系隔離 根據(jù)檢測結果，高青蒿素含量單株保留，低含量和未檢測的單株要在黃花蒿開花之前徹底清除，并做好試驗田以外的隔離工作，防止生物學混雜。

3.3.5 種子采收 11月中旬以后，種子開始成熟，當種子顏色臘黃色時，分單株采收，嚴防株系間種子機械混雜，晾干搓柔，種子分篩入袋保存。

3.4 選育結果

通過4年的系統(tǒng)選育，從表1可以看出，2010年掛牌檢測的50個單株中，青蒿素最低含量為0.212%，最高含量為40# 1.119%，群體內單株平均含量0.471%；2013年40#-53-02株系內26株檢測結果，單株最低含量提高至0.579%，最高含量提高至1.605%，群體內單株平均含量提高至0.972%，其原因是通過逐年選育，較高含量單株在株系整體中所占比例增加，平均含量也在逐年提高和逐年穩(wěn)定。其他各株系的各項含量均有顯著提高。

3.5 青蒿素高含量株系在大田栽培示范的測產(chǎn)和檢測結果

2013年對青蒿素高含量39#-20-11、39#-20-13、40#-30-08、40#-53-02、39#-20-09、40#-30-0909株系種子育苗，按1 m×1 m密度小面積示范栽培，田間肥水等管理與系統(tǒng)選育試驗田同步實施，其產(chǎn)量及青蒿素含量檢測結果如表2所示。

從2013年恩施清江生物工程有限公司自控基地黃花蒿原料入庫數(shù)據(jù)來看，一般單產(chǎn)1 800-2 250 kg/hm2，青蒿素含量0.500%～0.600%。從表2可以看出，系統(tǒng)選育出的高青蒿素含量株系后代群體單產(chǎn)均超過2 700 kg/hm2，其中有兩個株系突破3 000 kg/hm2；青蒿素含量均超0.800%，其中有兩個株系突破0.930%。所選育出的青蒿素高含量株系，無論在產(chǎn)量上還是在青蒿素含量上，均在大田小面積示范栽培得到驗證，證明課題組確定的選育目標性狀是科學的，取得了階段性選育成果。

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