液相色譜—質(zhì)譜法對柑橘中吡唑醚菌酯殘留的檢測

劉軍+張仙+沈菁+祁志紅

摘要：建立了高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測柑橘中吡唑醚菌酯殘留量的方法。柑橘經(jīng)乙腈提取，Carbon/NH2柱凈化，實現(xiàn)樣品的制備。在島津VP-ODS色譜柱上，以乙腈和0.1%甲酸溶液（70+30，V/V）為流動相，采用電噴霧正離子（ESI+） SIM掃描模式，以m/z 388為定量檢測離子，吡唑醚菌酯保留時間為6.3 min，在0.01～0.50 mg/L內(nèi)呈良好的線性關(guān)系， R2為0.999 8。在柑橘樣品（全果、果肉）中添加0.05、 0.20、 2.00 mg/kg的吡唑醚菌酯標準樣品，其回收率為101%～115%，相對標準偏差（RSD）均小于5%。最低檢出量（S/N=10）為3.4×10-13 g。準確度和精密度均能滿足檢測要求。

關(guān)鍵詞：吡唑醚菌酯；殘留；液相色譜-質(zhì)譜

中圖分類號：O657.63 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）19-4698-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.050

Determination of Pyraclostrobin Residue in Citrus by LC-MS

LIU Jun， ZHANG Xian， SHEN Jing， QI Zhi-hong

（Agricultural Quality Standards and Inspection Technology Research Institute， Hubei Academy of Agricultural Science， Wuhan 430064，China）

Abstract： A method for determing pyraclostrobin residues in whole fruit of citrus and citrus pulp was established with by LC-ESI-MS. Pyraclostrobin residues were extracted from samples with acetonitrile， cleaned up by ProElut Carbon/NH2 SPE to achieve sample preparation， and separated on the Shimadzu VP-ODS column， using a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid solution （70+30，V/V） as mobile phase. Determination was made by using ESI under the mode of SIM. Quantitative detection of ions was m/z 388， the retention time of pyraclostrobin was 6.3 min. Linearity were held in the ranges of 0.01～0.50 mg/L with the correlation coefficient of 0.999 8. The average recoveries of pyraclostrobin in whole fruit of citrus and citrus pulp at the spiked amounts of 0.05～2.00 mg/kg were 101%～115%， and the relative standard deviation was lower than 5.0%. The limit of detectable amount （S/N=10） was 1.3×10-13 g. The accuracy and precision of this method can meet the requirements of detection.

Key words： pyraclostrobin； residue； LC-ESI-MS

吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin），又名唑菌胺酯、百克敏，是兼具吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是由德國巴斯夫公司于1993年開發(fā)，2001年登記并上市，目前已用于100多種作物上，可以防治由多種真菌病原引起的病害[1]，同樣能夠防治柑橘的酸腐病、青霉病。目前，關(guān)于吡唑醚菌酯的檢測方法有吳潔珊等[2]采用氣相色譜測定柑橘中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量；薄海波等[3]采用氣相色譜—質(zhì)譜法測定食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留；徐英江等[4]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中殘留的唑菌胺酯；以及在西瓜[5]、甘藍[6]、葡萄[7]、花生[8]、土壤[9]等介質(zhì)中的殘留均有研究。

柑橘在采摘后的儲藏和運輸過程中容易發(fā)生酸腐病和青霉病，目前市場上對于防止柑橘儲藏和運輸過程中霉變腐爛多采用采摘前噴藥和采摘后浸藥的方式，但是用藥種類卻沒有統(tǒng)一的標準，而吡唑醚菌酯作為一種低毒高效的殺菌劑，浸果可以延緩其腐爛霉變。本研究旨在為吡唑醚菌酯在柑橘儲藏中使用申請的殘留試驗，對柑橘全果和柑橘果肉中的殘留檢測均有研究，針對性強、準確度高，能滿足殘留檢測要求。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司），配備LC-MS 2010 EV質(zhì)譜檢測器和電噴霧電離源，自動進樣器，LC-MS工作站。

吡唑醚菌酯標準樣品（99.7%，上海市農(nóng)藥研究所），甲醇、乙腈（色譜純，美國J.T.Baker公司），甲酸（99.0%，美國Acros Organics公司），氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），去離子水由Barnstead 超純水機制備，其他試劑均為分析純。

1.2 樣品前處理

稱取攪碎后的柑橘全果、果肉樣品10.0 g（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min勻質(zhì)2 min，加入3.0 g氯化鈉，高速渦旋1 min。以3 500 r/min離心5 min，移取出上清液5 mL（相當于2.5 g樣品）待凈化。

1.3 樣品凈化

將移取出的5 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）預(yù)淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脫，合并淋洗液，于70 ℃水浴鍋蒸發(fā)近干，用2.5 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，待質(zhì)譜檢測。

1.4 液相色譜—質(zhì)譜條件

色譜柱為島津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流動相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速為0.2 mL/min；進樣體積為5 μL；柱溫為35 ℃；離子源 ESI+，SIM 掃描模式（m/z 388）；CDL溫度為250 ℃； 加熱模塊溫度為200 ℃；霧化氣流速（N2）為1.5 L/min；干燥氣（N2）壓力為60 kPa；檢測電壓為1.75 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量離子的選擇

在上述色譜條件下選擇SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯標準品溶液，掃描得到全掃描質(zhì)譜圖（圖1）。由圖1可見，m/z 388（M+H）的為目標離子，所以選擇m/z 388 為定量離子。以m/z 388為定量離子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收圖譜、標準樣品圖譜以及空白譜圖見圖2，果肉中的譜圖見圖3。

2.2 線性范圍和檢出限

配制吡唑醚菌酯標準樣品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，經(jīng)儀器檢測，以m/z 388質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖4，其線性回歸方程為：y=697 983 8x+170 936 3，R2為0.999 8。按S/N=10的信噪比計算吡唑醚菌酯最低檢出量為3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脫溶劑體積的選擇

在空白柑橘樣品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯標準樣品，按上述方法提取，樣品凈化時洗脫溶劑乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分開收集，分別蒸發(fā)近干，定容2.5 mL，過0.22 μm濾膜，進質(zhì)譜檢測。檢測數(shù)據(jù)見表1。由表1可得，前10 mL已將目標物洗脫完全，為了確保在大量的樣品檢測過程中徹底洗脫，以15 mL為最佳淋洗體積。

2.4 方法的添加回收率和最小檢出濃度

在田間采摘未施藥的柑橘制成全果、果肉空白樣品，分別添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3個水平，每個水平重復5次，檢測結(jié)果見表2。從表2可得，添加樣品中吡唑醚菌酯加標回收率為 101%～115 %，相對標準偏差（n=5）為1.3 %～4.7 %。以最小添加濃度0.02 mg/kg作為最小檢出濃度，其回收率、相對標準偏差和最小檢測濃度都能滿足農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

3 小結(jié)與討論

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜法檢測吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的殘留，該方法操作簡單，其添加回收率、精確度和最小檢出濃度均能達到農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

參考文獻：

[1] 楊麗娟，柏亞羅.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑——吡唑醚菌酯[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2012，11（4）：46-50.

[2] 吳潔珊，馮家望，任永霞，等.氣相色譜測定柑橘中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量[J].農(nóng)藥，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.氣相色譜/質(zhì)譜法測定食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留[J].分析化學研究報告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，張秀珍，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中殘留的唑菌胺酯[J].化學研究與應(yīng)用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 張志勇，王冬蘭，劉賢進.西瓜與土壤中吡唑醚菌酯殘留的分析方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 巖，姚威風，梁 爽，等.甘藍和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰嗎啉殘留分析[J].農(nóng)藥，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建壘，宋國春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色譜殘留分析方法[J].農(nóng)藥科學與管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吳 迪，聶向云，張希躍，等.壤中吡唑醚菌酯的殘留分析方法和消解動態(tài)研究[J].農(nóng)藥科學與管理，2012，33（7）：25-28.

1.2 樣品前處理

稱取攪碎后的柑橘全果、果肉樣品10.0 g（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min勻質(zhì)2 min，加入3.0 g氯化鈉，高速渦旋1 min。以3 500 r/min離心5 min，移取出上清液5 mL（相當于2.5 g樣品）待凈化。

1.3 樣品凈化

將移取出的5 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）預(yù)淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脫，合并淋洗液，于70 ℃水浴鍋蒸發(fā)近干，用2.5 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，待質(zhì)譜檢測。

1.4 液相色譜—質(zhì)譜條件

色譜柱為島津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流動相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速為0.2 mL/min；進樣體積為5 μL；柱溫為35 ℃；離子源 ESI+，SIM 掃描模式（m/z 388）；CDL溫度為250 ℃； 加熱模塊溫度為200 ℃；霧化氣流速（N2）為1.5 L/min；干燥氣（N2）壓力為60 kPa；檢測電壓為1.75 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量離子的選擇

在上述色譜條件下選擇SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯標準品溶液，掃描得到全掃描質(zhì)譜圖（圖1）。由圖1可見，m/z 388（M+H）的為目標離子，所以選擇m/z 388 為定量離子。以m/z 388為定量離子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收圖譜、標準樣品圖譜以及空白譜圖見圖2，果肉中的譜圖見圖3。

2.2 線性范圍和檢出限

配制吡唑醚菌酯標準樣品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，經(jīng)儀器檢測，以m/z 388質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖4，其線性回歸方程為：y=697 983 8x+170 936 3，R2為0.999 8。按S/N=10的信噪比計算吡唑醚菌酯最低檢出量為3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脫溶劑體積的選擇

在空白柑橘樣品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯標準樣品，按上述方法提取，樣品凈化時洗脫溶劑乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分開收集，分別蒸發(fā)近干，定容2.5 mL，過0.22 μm濾膜，進質(zhì)譜檢測。檢測數(shù)據(jù)見表1。由表1可得，前10 mL已將目標物洗脫完全，為了確保在大量的樣品檢測過程中徹底洗脫，以15 mL為最佳淋洗體積。

2.4 方法的添加回收率和最小檢出濃度

在田間采摘未施藥的柑橘制成全果、果肉空白樣品，分別添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3個水平，每個水平重復5次，檢測結(jié)果見表2。從表2可得，添加樣品中吡唑醚菌酯加標回收率為 101%～115 %，相對標準偏差（n=5）為1.3 %～4.7 %。以最小添加濃度0.02 mg/kg作為最小檢出濃度，其回收率、相對標準偏差和最小檢測濃度都能滿足農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

3 小結(jié)與討論

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜法檢測吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的殘留，該方法操作簡單，其添加回收率、精確度和最小檢出濃度均能達到農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

參考文獻：

[1] 楊麗娟，柏亞羅.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑——吡唑醚菌酯[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2012，11（4）：46-50.

[2] 吳潔珊，馮家望，任永霞，等.氣相色譜測定柑橘中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量[J].農(nóng)藥，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.氣相色譜/質(zhì)譜法測定食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留[J].分析化學研究報告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，張秀珍，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中殘留的唑菌胺酯[J].化學研究與應(yīng)用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 張志勇，王冬蘭，劉賢進.西瓜與土壤中吡唑醚菌酯殘留的分析方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 巖，姚威風，梁 爽，等.甘藍和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰嗎啉殘留分析[J].農(nóng)藥，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建壘，宋國春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色譜殘留分析方法[J].農(nóng)藥科學與管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吳 迪，聶向云，張希躍，等.壤中吡唑醚菌酯的殘留分析方法和消解動態(tài)研究[J].農(nóng)藥科學與管理，2012，33（7）：25-28.

1.2 樣品前處理

稱取攪碎后的柑橘全果、果肉樣品10.0 g（精確到0.01 g）于100 mL離心管中，加入20 mL乙腈，以21 000 r/min勻質(zhì)2 min，加入3.0 g氯化鈉，高速渦旋1 min。以3 500 r/min離心5 min，移取出上清液5 mL（相當于2.5 g樣品）待凈化。

1.3 樣品凈化

將移取出的5 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）預(yù)淋洗Carbon/NH2柱（6 mL，1 000 mg），收集淋洗液，再用15 mL乙腈+甲苯（3∶1，V/V）分3次洗脫，合并淋洗液，于70 ℃水浴鍋蒸發(fā)近干，用2.5 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，待質(zhì)譜檢測。

1.4 液相色譜—質(zhì)譜條件

色譜柱為島津VP-ODS （150 mm×2.0 mm ， 5 μm）；流動相采用含 0.1%甲酸溶液和乙腈（70+30， V/V）；流速為0.2 mL/min；進樣體積為5 μL；柱溫為35 ℃；離子源 ESI+，SIM 掃描模式（m/z 388）；CDL溫度為250 ℃； 加熱模塊溫度為200 ℃；霧化氣流速（N2）為1.5 L/min；干燥氣（N2）壓力為60 kPa；檢測電壓為1.75 kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 定量離子的選擇

在上述色譜條件下選擇SCAN（+）模式，以10 mg/L的吡唑醚菌酯標準品溶液，掃描得到全掃描質(zhì)譜圖（圖1）。由圖1可見，m/z 388（M+H）的為目標離子，所以選擇m/z 388 為定量離子。以m/z 388為定量離子采用SIM（+）模式，柑橘全果中的吡唑醚菌酯的添加回收圖譜、標準樣品圖譜以及空白譜圖見圖2，果肉中的譜圖見圖3。

2.2 線性范圍和檢出限

配制吡唑醚菌酯標準樣品0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L，經(jīng)儀器檢測，以m/z 388質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標，以對應(yīng)的吡唑醚菌酯質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖4，其線性回歸方程為：y=697 983 8x+170 936 3，R2為0.999 8。按S/N=10的信噪比計算吡唑醚菌酯最低檢出量為3.4×10-13 g。

2.3 SPE柱洗脫溶劑體積的選擇

在空白柑橘樣品10.0 g中添加0.10 mg/kg水平的吡唑醚菌酯標準樣品，按上述方法提取，樣品凈化時洗脫溶劑乙腈和甲苯（3∶1，V/V）的用量按每次5 mL，共5次分開收集，分別蒸發(fā)近干，定容2.5 mL，過0.22 μm濾膜，進質(zhì)譜檢測。檢測數(shù)據(jù)見表1。由表1可得，前10 mL已將目標物洗脫完全，為了確保在大量的樣品檢測過程中徹底洗脫，以15 mL為最佳淋洗體積。

2.4 方法的添加回收率和最小檢出濃度

在田間采摘未施藥的柑橘制成全果、果肉空白樣品，分別添加0.05、0.20、2.00 mg/kg 3個水平，每個水平重復5次，檢測結(jié)果見表2。從表2可得，添加樣品中吡唑醚菌酯加標回收率為 101%～115 %，相對標準偏差（n=5）為1.3 %～4.7 %。以最小添加濃度0.02 mg/kg作為最小檢出濃度，其回收率、相對標準偏差和最小檢測濃度都能滿足農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

3 小結(jié)與討論

本研究采用乙腈提取，Carbon/NH2柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜法檢測吡唑醚菌酯在柑橘（全果、果肉）中的殘留，該方法操作簡單，其添加回收率、精確度和最小檢出濃度均能達到農(nóng)藥登記殘留試驗的要求。

參考文獻：

[1] 楊麗娟，柏亞羅.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑——吡唑醚菌酯[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2012，11（4）：46-50.

[2] 吳潔珊，馮家望，任永霞，等.氣相色譜測定柑橘中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量[J].農(nóng)藥，2011，50（10）：754-755.

[3] 薄海波，王金花，郭春海，等.氣相色譜/質(zhì)譜法測定食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留[J].分析化學研究報告，36（11）：1471-1475.

[4] 徐英江，耿金培，張秀珍，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中殘留的唑菌胺酯[J].化學研究與應(yīng)用，2009，21（12）：1704-1707.

[5] 張志勇，王冬蘭，劉賢進.西瓜與土壤中吡唑醚菌酯殘留的分析方法[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（34）：19386-19387.

[6] 王 巖，姚威風，梁 爽，等.甘藍和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰嗎啉殘留分析[J].農(nóng)藥，2011，50（1）：46-47.

[7] 李瑞娟，于建壘，宋國春.葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色譜殘留分析方法[J].農(nóng)藥科學與管理，2010，31（6）：33-36.

[8] ZHANG F Z，WANG L，ZHOU L，et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LC-MS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，78（4）：116-122.

[9] 吳 迪，聶向云，張希躍，等.壤中吡唑醚菌酯的殘留分析方法和消解動態(tài)研究[J].農(nóng)藥科學與管理，2012，33（7）：25-28.