李丹，初陽（1.沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院藥學部，沈陽11004；.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，沈陽11004）

透明質酸（Hyaluronic acid，HA）及其鈉鹽是廣泛存在于人體及動物體內的一種黏多糖，是體內重要的生理活性物質，廣泛應用于食品、日化和醫(yī)藥領域[1-2]；其在組織形成、細胞調控及血管生成方面都起著重要的作用[3]。HA本身具有良好的生物相容性、高黏彈性和毒副作用小等優(yōu)點，既可延緩皮膚衰老，補充皮膚水分；又可促進傷口愈合，防止疤痕產生[4-5]。雖然已有上市的含HA的化妝品[6]，但其僅作為保濕劑出現，并非作為主要成分使用，因此藥用效果不明顯，也不適合大規(guī)模藥用。

本文以透明質酸鈉為模型藥物，海藻酸鈉為骨架材料，采用乳化-交聯法制備了包載透明質酸鈉的海藻酸鈉微球。該制劑處方選擇和制備工藝的關鍵是利用微球所形成的不溶性骨架，以降低透明質酸鈉的釋放速度，延長釋藥時間，從而達到提高生物利用度的目的。本研究可為進一步制備透明質酸鈉緩釋制劑奠定基礎。

1 材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；FA1104電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；UV-9100型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；DMBA450生物數碼顯微鏡（麥克迪實業(yè)集團有限公司）；LS320激光粒度儀（美國Beckman公司）。

三乙醇胺（天津市博迪化工有限公司）；透明質酸鈉（山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，批號：0911062，藥用級，含量：99.5%）；海藻酸鈉（河北大唐生物工程有限公司，藥用級）；海藻酸鈉微球（沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院藥學部）；對羥基苯甲酸乙酯、氯化鈣、聚山梨酯80均為藥用級；二氯甲烷、異丙醇、液體石蠟、丙三醇、硬脂酸、白凡士林、阿利新藍均為分析純。

2 方法與結果

2.1 透明質酸鈉含量測定方法的建立

精密稱量透明質酸鈉，用去離子水溶解后配成質量濃度為53.15、106.3、212.6、318.9、425.2 mg/L的標準溶液，搖勻。取上述標準溶液各1 ml，加入10 ml量瓶中，加6 ml阿利新藍染料染色，混合后用去離子水稀釋至刻度，作為顯色溶液。在510 nm波長處測定各溶液的吸光度值。以透明質酸鈉質量濃度（ρ）為橫坐標，標準溶液與顯色溶液的吸光度差值（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝0.0017ρ+0.1848（r＝0.9980，n＝5）。結果表明，透明質酸鈉檢測質量濃度線性范圍為53.15～425.2 mg/L。低、中、高3個質量濃度（53.15、212.6、425.2 mg/L）的標準溶液的日內精密度RSD分別為1.88%、0.80%、0.63%（n＝5）；日間精密度RSD分別為2.57%、1.05%、0.84%（n＝5）；平均回收率為（97.9±1.80）%，RSD＝1.84%（n＝3）。

2.2 透明質酸鈉微球的制備

稱取適量透明質酸鈉，精密稱定，溶入蒸餾水中，超聲溶解后，將適量海藻酸鈉細粉溶于其中配成一定濃度的海藻酸鈉溶液，靜置除去氣泡，后用醫(yī)用9號注射器緩緩滴入攪拌的混合油相中。以一定的分散轉速磁力攪拌分散一定時間后，加入適量用氯化鈣飽和的交聯劑，固化[7]。將制得的微球分別用異丙醇洗滌2～3次，抽濾后，40℃干燥6 h，密封貯藏備用。

2.3 透明質酸鈉包封率及載藥量的測定

取制備的海藻酸鈉微球50 mg，置于蒸餾水5 ml中超聲10 min；37℃放置24 h，取上清液置于10 ml量瓶中，研磨微球至其破碎，離心15 min，將上清液吸取于量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至10 ml；用0.45 μm微孔濾膜濾過。測定上清液中的藥物含量，計算微球中藥物的包封率及載藥量：包封率＝微球中包裹的透明質酸鈉質量/透明質酸鈉加入量×100%；載藥量＝微球中包裹的透明質酸鈉質量/微球的質量×100%。

2.4 處方因素的考察

經過多次預試驗，確定對包封率影響較大的幾個處方因素，考察結果如下。

2.4.1 海藻酸鈉質量分數。固定其他的因素，考察海藻酸鈉的質量分數。分別配成含有1%透明質酸鈉的1%、2%、3%海藻酸鈉溶液，滴入二氯甲烷與植物油等比例組成的混合油相中，以300 r/min轉速分散15 min，加入交聯劑90 min后制備海藻酸鈉微球，其水相與交聯劑體積比為1∶1，透明質酸鈉與海澡酸鈉質量比為1∶2。結果顯示，當海藻酸鈉質量分數為1%時，黏度較低，無法成球；當海藻酸鈉質量分數為2%時，可成球，且干燥后球之間無粘連，鏡下觀察微球形態(tài)較好，包封率為（45.17±6.12）%（n＝3）；當海藻酸鈉質量分數為3%時，雖然包封率較高（57.28±5.54）%（n＝3），但由于黏度較大，微球形態(tài)不佳。因此，選擇海藻酸鈉質量分數為2%。

2.4.2 混合油相比例。固定海藻酸鈉質量分數為2%，制備方法同“2.4.1”項，選擇植物油與二氯甲烷的混合油相，體積比為3∶1、2∶2、1∶3，并加入2%油酸山梨坦作為油相的表面活性劑，制備海藻酸鈉微球。結果顯示，當體積比為3∶1和2∶2時，混合油相黏度大，干燥后微球粘連嚴重，微球形態(tài)不佳，包封率分別為（38.94±8.46）%（n＝3）和（37.25±8.14）%（n＝3）。因此，選擇體積比為1∶3，此時包封率為（45.17±6.12）%（n＝3）。

2.4.3 交聯劑加入體積。以2%海藻酸鈉溶液作為內水相，植物油與二氯甲烷體積比為1∶3的混合油為油相，令水相與加入交聯劑的體積比為2∶1、1∶1、1∶2，按“2.4.1”項下方法制備海藻酸鈉微球。結果包封率依次為（38.97±4.43）%、（45.17±6.12）%和（43.86±7.35）%（n＝3），表明當體積比超過1∶1后，再提高交聯劑的量，微球的包封率基本不再變化，粒徑減小不明顯。因此，選擇水相與交聯劑體積比為1∶1。

2.4.4 透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比。分別配制透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比為1∶4、1∶2、1∶1的溶液為水相，水相與交聯劑的體積比為1∶1，按“2.4.3”項下方法制備海藻酸鈉微球。結果包封率依次為（48.93±8.69）%、（45.17±6.12）%和（31.96±7.54）%（n＝3），載藥量依次為（6.99±1.64）%、（11.29±2.16）%和（12.78±2.71）%（n＝3），表明透明質酸鈉與海藻酸鈉比例增加，微球載藥量增加，包封率明顯降低。因此，綜合考慮，選擇質量比為1∶2。

2.5 工藝因素的考察

經過多次預試驗，確定了對包封率影響較大的幾個工藝因素，考察結果如下。

2.5.1 分散時間。以2%海藻酸鈉溶液為水相,透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比為1∶2，含2%油酸山梨坦、混合油相比例為1∶3的混合油為油相，水相與交聯劑體積比為1∶1，以300 r/min轉速分散5、15、30 min，加入交聯劑90 min后制備海藻酸鈉微球，制備方法同“2.2”項。結果包封率分別為（37.4±4.37）%、（45.17±6.12）%和（46.26±8.49）%（n＝3），表明隨著時間增加，包封率增加，但時間過長會使微球粘連。因此，選擇分散時間為15 min。

2.5.2 分散轉速。固定分散時間為15 min，分別在100、300、500 r/min下按“2.4.1”項下方法制備海藻酸鈉微球。結果包封率分別為（56.48±8.96）%、（45.17±6.12）%和（34.32±7.34）%（n＝3），表明隨轉速增加，包封率下降，但轉速過低微球粒徑大，分布不均。因此，選擇分散轉速為300 r/min。

2.5.3 交聯時間。固定分散轉速為300 r/min，交聯時間分別為30、90、150 min下按“2.2”項下方法制備海藻酸鈉微球。結果包封率分別為（31.76±3.62）%、（45.17±6.12）%和（47.03±5.73）%（n＝3），表明隨著交聯時間延長，包封率增加，但增加到90 min后，再延長交聯時間，包封率提高不明顯，且微球有粘連現象。因此，交聯時間選擇90 min。

2.6 包載透明質酸鈉的海藻酸鈉微球處方的優(yōu)化

根據單因素考察結果，選取透明質酸鈉質量分數、透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比、交聯時間和分散轉速為因素進行正交試驗，以包封率為指標對處方進行優(yōu)化，篩選出包封率高、形態(tài)好的微球最優(yōu)處方。影響因素及因素水平取值見表1，正交試驗設計及試驗結果見表2，極差分析見表3，方差分析見表4。

表1 影響因素及因素水平取值Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗設計及試驗結果Tab 2 Orthogonal design and results

表3 正交試驗結果極差分析Tab 3 Results of analysis of range

表4 正交試驗結果方差分析Tab 4 Results of analysis of variance

由表2可見，各因素對指標的影響程度順序為C＞A＞B＞D，最佳水平為A2B1C2D1，即海藻酸鈉質量分數為2%，透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比為1∶3，交聯時間為90 min，分散轉速為200 r/min。

由表3可見，交聯時間對微球的包封率有顯著影響，而海藻酸鈉質量分數、透明質酸鈉與海藻酸鈉質量比及分散轉速對包封率影響不明顯。

2.7 驗證試驗

按最優(yōu)處方制備3批微球，其形態(tài)圓整、粒徑分布均勻，測得包封率為（58.92±3.06）%，載藥量為（10.96±1.12）%；將微球分散于水中，滴入激光粒度測定儀，測得微球平均粒徑為（107.8±5.51）μm。

3 討論

氯化鈣的水溶液相當于水相，其在油相中也以液滴形式被分散，因此與海藻酸鈉液滴接觸幾率很小，且液滴各點交聯不均，交聯效果不佳。用氯化鈣飽和的二氯甲烷可與油互溶，加入后，可以在海藻酸鈉液滴周圍形成均勻的交聯劑濃度，即液滴各點交聯均勻。故本文選擇氯化鈣溶液飽和的二氯甲烷為交聯劑。

一次性加入交聯劑，只是在最初形成交聯劑的濃度梯度，隨著交聯劑的消耗，濃度梯度降低，交聯效果會變差，內層交聯不完全，所以包封率較低，粒徑稍大，但形態(tài)較好。分次加入交聯劑可以在不同時間點始終保持著濃度梯度，交聯效果好，交聯程度深，包封率高，粒徑小，形態(tài)好。

分散轉速顯著影響微球粒徑及形態(tài)。當分散轉速為100 r/min時，提供的外力不足以降低水相的粒徑，使得微球大小不一；但由于轉速低，水相中藥物滲漏量小，包封率較高。當轉速為500 r/min時，粒徑雖小，但包封率降低，體系黏度增加，出現粘連現象。

因本文中劑型為中間劑型，最終劑型為乳膏劑，故對粒徑考慮不多，僅是在驗證試驗時測量了粒徑，試驗時也只是在顯微鏡下觀察了微球的形態(tài)，未照電鏡。

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