劉憲勇，劉世軍，孫克明，張 敏，畢文超，王 巖（武警山東總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，濟(jì)南 250014）

奧拉西坦是由意大利ISF公司于1974年首先合成的吡咯烷酮類衍生物，為新一代腦代謝改善藥，其口服制劑和注射制劑分別于1987年和1990年在意大利首次上市。本品適用于輕中度血管性癡呆、老年性癡呆以及腦外傷等引起的記憶與智能障礙[1-3]，其不良反應(yīng)少[4]、耐受性好[5]。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局試行標(biāo)準(zhǔn)中的奧拉西坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查分別采用的是以色譜柱為氰基柱和C8的高效液相色譜（HPLC）法[6-7]，另有文獻(xiàn)報(bào)道采用色譜柱為多聚物柱[8]、氨基柱的HPLC法。由于奧拉西坦合成工藝不同所引入的雜質(zhì)如合成原料[甘氨酰胺鹽酸鹽和4-氯乙酰乙酸乙酯（CEA）]、中間體（4-氯-3-羥基丁酸乙酯）、副產(chǎn)物等不同，因此為控制按本文中合成路線合成的奧拉西坦原料藥的質(zhì)量，筆者參考奧拉西坦含量及有關(guān)物質(zhì)檢查方法[9-12]建立了色譜柱為C18、流動(dòng)相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）等的HPLC法。結(jié)果表明，建立的色譜分析方法能夠檢出更多的雜質(zhì)，且該色譜柱成本低。因此，最終確定本試驗(yàn)建立的HPLC法作為測(cè)定奧拉西坦原料藥中有關(guān)物質(zhì)的限量檢查方法。

奧拉西坦的合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 奧拉西坦的合成路線圖Fig 1 Synthesis route of oxiracetam

1 材料

1.1 儀器

日立L-7100型HPLC儀、L-7420紫外檢測(cè)器（日本日立公司）；LC-20AT HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

甘氨酰胺鹽酸鹽（武漢銀河化工有限公司，批號(hào)：08-220，化學(xué)純）；CEA（青島寒冰化工有限公司，批號(hào)：08-220，化學(xué)純）；中間體（批號(hào)：Z100901）、奧拉西坦原料藥粗品（批號(hào)：C100903）、奧拉西坦原料藥精品（批號(hào)：110201、110301、110302，純度：99.8%、99.9%、99.8%）均為本院自制；奧拉西坦對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101032-200901，純度：99.7%）。

2 色譜條件的選擇

流動(dòng)相Ⅰ：參考奧拉西坦試行標(biāo)準(zhǔn)[6]，以甲醇-水（2∶3）為流動(dòng)相Ⅰ。

流動(dòng)相Ⅱ：參考文獻(xiàn)[12]，以0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）為流動(dòng)相Ⅱ。由于此流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度較高，易造成色譜柱堵塞，因此不采用此流動(dòng)相。

流動(dòng)相Ⅲ：經(jīng)大量試驗(yàn)篩選確定以0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）為流動(dòng)相Ⅲ。

色譜柱：月旭XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μl。

在流動(dòng)相Ⅰ條件下，甘氨酰胺鹽酸鹽、奧拉西坦峰與中間體峰保留時(shí)間分別為2.115、3.130、4.445 min，奧拉西坦的色譜峰保留時(shí)間太小，不能有效檢驗(yàn)出樣品中的雜質(zhì)。故選擇在流動(dòng)相Ⅲ條件下，進(jìn)行方法學(xué)考察試驗(yàn)。

3 方法學(xué)考察

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密稱取甘氨酰胺鹽酸鹽、CEA、中間體和奧拉西坦對(duì)照品適量，加流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別約為30、5、10、10 μg/ml的溶液，作為分離度試驗(yàn)溶液。精密量取此溶液20 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。

由圖2結(jié)果表明，奧拉西坦色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰均能有效分離，采用該色譜條件，可有效檢出奧拉西坦原料藥中合成原料及中間品殘留，故初步確定此色譜條件為有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖1.甘氨酰胺；2.奧拉西坦；3.中間體；4.CEAFig 2 Chromatograms of system suitability test1.glycinamide；2.oxiracetam；3.intermediate；4.CEA

3.2 破壞試驗(yàn)

稱取奧拉西坦原料藥精品（批號(hào)：110201）約11 mg 6份，分別置于10 ml量瓶中，分別進(jìn)行如下處理：（1）加流動(dòng)相溶解；（2）加入1 mol/L的鹽酸溶液2.0 ml，室溫放置2 h，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性；（3）加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液0.2 ml，室溫放置3 min，立即用0.5 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性；（4）加入30%雙氧水2.0 ml，室溫放置1 h（另取流動(dòng)相同法操作，作為氧化破壞空白溶液）；（5）于沸水中加熱8 h，冷卻至室溫；（6）置于4500 lx的光照條件下，照射48 h。上述各處理后溶液均加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液分別作為破壞前溶液及酸、堿、氧化、高溫、強(qiáng)光破壞后溶液。

分別精密量取上述溶液各20 μl，注入色譜儀，色譜見(jiàn)圖3，各分離指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表1[其中分離度指主峰與最近雜質(zhì)峰的分離度，物料平衡結(jié)果＝（破壞后峰總面積×破壞前稱樣量）/（破壞前峰總面積×破壞稱樣量）]。

由圖3和表1可見(jiàn)，本品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、強(qiáng)光破壞試驗(yàn)，破壞出的各雜質(zhì)峰均能與主峰完全分離，主峰純度良好，不包含其他色譜峰；物料平衡結(jié)果表示，破壞試驗(yàn)中破壞出的雜質(zhì)都能有效檢出，表明該色譜條件適用于本品有關(guān)物質(zhì)檢查。確定采用該色譜條件進(jìn)行奧拉西坦原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查。

3.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

稱取奧拉西坦對(duì)照品10.14 mg置于100 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 ml置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取上述貯備溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（c，μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，得線性方程：A＝29538c+134.4（r＝0.9997，n＝5）。結(jié)果表明，奧拉西坦檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.2104～0.6312 μg/ml。

3.4 精密度試驗(yàn)

稱取奧拉西坦對(duì)照品10.23 mg，置于10 ml量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為溶液a；精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為溶液b。精密量取上述溶液各20 μl分別注入色譜儀，記錄色譜圖，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，溶液a和溶液b峰面積的RSD分別為0.31%和0.12%（n＝6），表明精密度良好。

圖3 破壞試驗(yàn)色譜圖A.酸破壞后溶液；B.堿破壞后溶液；C.氧化破壞后溶液；D.高溫破壞后溶液；E.強(qiáng)光破壞后溶液；F.破壞前溶液；1.奧拉西坦Fig 3 Chromatograms of destory testA.solution destroyed by acid；B.solution destroyed by base；C.solution destroyed by oxidation；D.solution destroyed by heat；E.solution destroyed by light；F.solution undestroyed；1.oxiracetam

表1 破壞試驗(yàn)各指標(biāo)結(jié)果Tab 1 Evaluation results of destroy test

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“4”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：110201）分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣記錄色譜圖，計(jì)算主峰面積和雜質(zhì)的RSD。結(jié)果，主峰峰面積的RSD＝0.67%、最大單個(gè)雜質(zhì)峰面積的RSD＝2.28%、總雜質(zhì)的RSD＝4.90%（n＝5）。表明測(cè)定溶液在放置過(guò)程中雜質(zhì)不斷增大，因此確定本品測(cè)定溶液配制后須立即進(jìn)樣。

3.6 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)

取奧拉西坦對(duì)照品，精密稱定，用流動(dòng)相逐步稀釋并取樣檢測(cè)，按信噪比約為3、10時(shí)分別得出奧拉西坦檢測(cè)限、定量限為0.95、3.95 ng。

4 樣品中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

稱取奧拉西坦精品適量，用流動(dòng)相制成約1.0 mg/ml的溶液作為供試品溶液；精密量取供試品適量，用流動(dòng)相逐步稀釋成0.01 mg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液。在上述確定的色譜條件下，分別精密量取上述溶液各20 μl，注入色譜儀，記錄色譜圖，用主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量。結(jié)果3批樣品（批號(hào)：110201、110301、110302）的最大單個(gè)雜質(zhì)量分別為0.02%、0.03%、0.03%，總雜質(zhì)量分別為0.02%、0.03%、0.03%。

5 討論

采用現(xiàn)有的奧拉西坦質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的方法，檢測(cè)到的雜質(zhì)數(shù)量少，對(duì)合成的中間體和降解產(chǎn)物無(wú)法有效分離和檢出。本文所建立的奧拉西坦有關(guān)物質(zhì)檢查方法（與標(biāo)準(zhǔn)方法的區(qū)別只是流動(dòng)相和色譜柱）條件下，奧拉西坦出峰時(shí)間適中，流動(dòng)相中緩沖鹽濃度較小，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定中各雜質(zhì)峰與奧拉西坦峰能有效分離；本文提到的合成工藝中可能引入的工藝雜質(zhì)及破壞試驗(yàn)中的降解雜質(zhì)不影響奧拉西坦雜質(zhì)的測(cè)定。

綜上所述，采用本色譜條件進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，能有效控制奧拉西坦原料藥中的有關(guān)物質(zhì)。

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