周 昊 王成章 葉建中 陳虹霞 陶 冉

（1．中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042；2．中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料的需求量越來越大。而飼料生產(chǎn)量，尤其是蛋白飼料的不足已經(jīng)成為全球性問題，因此積極利用各種廢棄物生產(chǎn)蛋白飼料已成為國內(nèi)外研究的熱點[1-2]。銀杏葉渣是生產(chǎn)銀杏提取物過程中產(chǎn)生的廢渣，我國每年大概產(chǎn)生3萬噸的銀杏葉渣，銀杏葉渣中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、VC、VE、胡蘿卜素、礦物質(zhì)和微量元素等營養(yǎng)成分，目前銀杏葉渣大多未加利用，被直接扔掉或焚燒，不僅造成資源的嚴重浪費，而且嚴重污染環(huán)境[3-4]。

固態(tài)發(fā)酵技術(shù)相對于液態(tài)發(fā)酵技術(shù)具有高產(chǎn)、簡易、低投資、低能耗等優(yōu)點[5]，特別是應(yīng)用于廢渣廢料的處理，易干燥、高回收，可把發(fā)酵物（包括發(fā)酵底物、菌體及其代謝產(chǎn)物）全部利用，既保留了活性成分又不會產(chǎn)生廢液污染[6]。因此利用微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，用銀杏葉提取物加工過程中產(chǎn)生的大量銀杏葉渣生產(chǎn)出蛋白飼料，提高銀杏葉渣的蛋白質(zhì)含量及營養(yǎng)價值，可變廢為寶，開辟飼料新資源，避免廢渣對環(huán)境的污染，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。本研究以銀杏葉渣為原料，以米曲霉、枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和熱帶假絲酵母混合菌種為發(fā)酵菌種，研究了銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料適宜的工藝條件，對提高銀杏葉渣的綜合利用價值，減少環(huán)境污染具有深遠的意義。

1 試驗材料與儀器

1.1 材料

原輔料：銀杏葉渣：由邳州鑫源生物制品有限公司提供。本文中若無特別說明，藥渣質(zhì)量均以絕干物料計量。

試劑：尿素、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等，均為分析純。

培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：5°Bé～6°Bé，pH值約為6.5，加入2 g/100 ml瓊脂即可。不加瓊脂即為麥芽汁液體培基。

Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖3%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.001%，K2HPO40.1%，瓊脂1.5%，pH值6.0～6.5。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液中加入2%葡萄糖和1.5%瓊脂。

MRS培養(yǎng)基：酪蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸二胺0.2%，吐溫80 0.1%，K2HP040.2%，MgS04·7H2O 0.02%，MnSO4·H2O 0.005%，CaCO32%,瓊脂1.5%，pH 6.8。

BPY瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂1.5%，pH7.0。

1.2 試驗菌種

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）2.1776、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）2.1059、白地霉（Geotrichum candidum）2.1132、米曲霉（Aspergillus oryzae）3.5232、黑 曲 霉（Aspergillusniger）3.5439、綠 色 木 霉（Trichoderma viride）3.5455、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp.Subtilis）1.1630、植 物 乳 桿 菌（Lactobacillus plantarum）1.0556（中國普通微生物菌種保藏管理中心）。

1.3 試驗儀器

生化培養(yǎng)箱（RXZ-280B）：寧波江南儀器廠；往復(fù)式水浴恒溫搖床（ZWY-110X30）：上海智城分析儀器制造有限公司；凱氏定氮儀（KDN-08D）：上海昕瑞儀器儀表有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠；潔凈工作臺（SW-CJ-2D）∶蘇州凈化設(shè)備有限公司。

2 試驗方法

2.1 菌種的擴大培養(yǎng)[7]

黑曲霉菌和米曲霉菌：分別將黑曲霉菌、米曲霉菌原種接到Czapek’s瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，再接到250 ml三角瓶Czapek’s液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床（120 r/min）培養(yǎng)72 h。

熱帶假絲酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉：分別將熱帶假絲酵母菌、產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉原種接到麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，再接到250 ml三角瓶麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床（120 r/min）培養(yǎng)72 h。

綠色木霉：將綠色木霉原種接到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)72 h，再接到250 ml三角瓶PDA液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床（120 r/min）培養(yǎng)72 h。

枯草芽孢桿菌：將枯草芽孢桿菌原種接到BPY瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)72 h，再接到250 ml三角瓶BPY液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床（120 r/min）培養(yǎng)72 h。

植物乳桿菌：將植物乳桿菌原種接到MRS斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)72 h，再接到250 ml三角瓶MRS液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床（120 r/min）培養(yǎng)72 h。

2.2 銀杏葉渣發(fā)酵工藝流程

斜面菌種→種子培養(yǎng)↓銀杏葉渣→干燥→粉碎過40目篩→配料→混合→固態(tài)恒濕發(fā)酵→烘干至恒重→分析測定。

2.3 銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

2.3.1 單一菌種發(fā)酵試驗

在250 ml的錐形瓶中裝入混合均勻的銀杏葉渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比為1∶3，氮源添加量為5%，滅菌，冷卻后，分別接入10%的熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、米曲霉、黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌,在30℃，自然pH值下靜止發(fā)酵72 h后,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

2.3.2 復(fù)合菌種發(fā)酵試驗[8]

將單菌發(fā)酵試驗中篩選出的粗蛋白含量較高的酵母菌、霉菌與植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌進行進行2菌（接種比例1∶1）、3菌（接種比例1∶1∶1）和4菌（接種比例1∶1∶1∶l）的復(fù)合發(fā)酵試驗。復(fù)合菌種的組合有7種，分別為①霉菌+酵母菌；②霉菌+枯草芽抱桿菌；③霉菌+植物乳桿菌；④霉菌+酵母菌+枯草芽抱桿菌；⑤霉菌+酵母菌+植物乳桿菌；⑥霉菌+枯草芽抱桿菌+植物乳桿菌；⑦霉菌+酵母菌+枯草芽抱桿菌+植物乳桿菌。

2.3.3 最佳菌種比例試驗[9]

為得到最佳菌種比例組合，向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按10%的接種量接入不同比例的酵母菌、霉菌、枯草芽抱桿菌和植物乳桿菌的菌液，進行發(fā)酵試驗，接種比例分別為 1∶1∶2∶1、2∶2∶1∶1、1∶2∶2∶1、2∶1∶1：1、2∶1∶2∶1、1∶2∶1∶1，測定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量。

2.3.4 接種量的確定[10]

將篩選出的復(fù)合菌種分別按6%、8%、10%、12%、15%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比為1：3，氮源添加量為8%，滅菌，冷卻后，在30℃，自然pH值下靜止發(fā)酵72 h后,將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

2.3.5 發(fā)酵時間的確定

將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比為1：3，氮源添加量為8%，滅菌，冷卻后，在30℃，自然pH值下，分別靜止發(fā)酵A：24 h，B：48 h，C：72 h，D：96 h，E：120 h，將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

2.3.6 料水比的確定[11]

將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比分別取1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，氮源添加量為8%，滅菌，冷卻后，在30℃，自然pH值下，分別靜止發(fā)酵72 h，將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

2.3.7 氮源（尿素）添加量的確定[12]

將篩選出的復(fù)合菌種分別按10%的接種量接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比為1：3，分別選取尿素和硫酸銨作為培養(yǎng)基氮源，氮源添加量分別為3%、5%、8%、10%、12%，滅菌，冷卻后，在30℃，自然pH值下，分別靜止發(fā)酵72 h，將產(chǎn)物在50℃條件下烘干至恒重,分析測定其粗蛋白含量。

2.4 指標成分測定方法

銀杏葉渣中粗蛋白測定采用凱氏定氮法（GB/T6432-94），粗纖維測定采用酸堿洗滌法（GB/T6434-94），粗灰分測定采用高溫灼燒法（GB/T6438-2007），粗脂肪測定采用索氏提取法（GB/T6433-94），多糖測定采用硫酸蒽酮法（GB/T15038-2006）。

3 結(jié)果與討論

3.1 單一菌種發(fā)酵試驗（見圖1）

從圖1可以看出，向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入單一菌種均能提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量，而發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高的4種菌種為A熱帶假絲酵母（28.22%）、D米曲霉（32.55%）、G枯草芽抱桿菌（29.01%）和H植物乳桿菌（27.97%）。加入熱帶假絲酵母后的固體發(fā)酵產(chǎn)物中，有淡淡的醇香味，粗蛋白含量提高2.06倍，其原因在于熱帶假絲酵母自身中的菌體蛋白含量比較高；加入枯草芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可以提高2.14倍，這是由于其菌體內(nèi)具有活性較高的蛋白酶，可用合成大量的蛋白質(zhì)，來提高粗蛋白含量；加入米曲霉，發(fā)酵產(chǎn)物表面形成大片的白色菌絲體，之后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量提高了2.53倍，其原因是米曲霉可產(chǎn)生大量的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶，能使銀杏葉渣中的纖維素分解為可利用的碳源，促進發(fā)酵效果，同時產(chǎn)生蛋白質(zhì)；加入植物乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可以提高2.03倍，其原因在于其可產(chǎn)生大量的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶，從而可促進蛋白質(zhì)的合成。因此，在以后的混合菌種發(fā)酵試驗中所選用的菌株為：A熱帶假絲酵母、D米曲霉、G枯草芽抱桿菌和H植物乳桿菌。

3.2 復(fù)合菌種發(fā)酵試驗

根據(jù)單一菌種發(fā)酵實驗結(jié)果選出的發(fā)酵產(chǎn)品蛋白含量較高的熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽抱桿菌和植物乳桿菌進行復(fù)合菌種的組合試驗，分別為D+A（米曲霉+熱帶假絲酵母）、D+G（米曲霉+枯草芽孢桿菌）、D+H（米曲霉+植物乳桿菌）、D+A+G（米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌）、D+A+H（米曲霉+熱帶假絲酵母+植物乳桿菌）、D+G+H（米曲霉+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌）、D+A+G+H（米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌）。

從圖2可以看出，3菌和4菌組合發(fā)酵的產(chǎn)物的粗蛋白含量明顯高于2菌組合，其中米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌的3菌組合和米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌的4菌組合發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量最高，分別為40.57%和41.26%。通過觀察發(fā)酵產(chǎn)物，在產(chǎn)物表面及內(nèi)部有大量菌絲體，發(fā)酵產(chǎn)物成褐色，具有濃郁的酒香味。分析其中原因，是因為米曲霉能夠產(chǎn)生多種纖維素酶類和果膠酶類，這些酶類有助于銀杏葉渣中纖維素的降解，同時產(chǎn)生糖類物質(zhì)，而枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母可以利用這些糖類物質(zhì)大量生產(chǎn)并產(chǎn)生菌體蛋白，通過復(fù)合菌劑中不同微生物的協(xié)同作用最終提高發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量。由于米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌的3菌組合和米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌的4菌組合發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量相差不大，但是考慮到植物乳桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸，可使物料處于低酸度的環(huán)境，從而有效防止有機物質(zhì)和原料的變質(zhì)，使有益微生物急劇增加，抑制了有害細菌的生長，能增強動物的體液免疫和細胞免疫，另外加入植物乳桿菌還可以改善飼料的適口性。綜合考慮，選擇最佳菌種組合為米曲霉+熱帶假絲酵母+枯草芽孢桿菌+植物乳桿菌。

3.3 最佳菌種比例試驗（見圖3）

由圖3可知，當(dāng)熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的接種比例為2∶2∶1∶1時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高，達到45.85%。接入米曲霉比例為1時的菌種組合的發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量都偏低，這是由于米曲霉產(chǎn)生的糖化酶及纖維素酶減少，不利于銀杏葉渣中的纖維素分解。同時發(fā)酵物料中可利用的糖減少，使得熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的生長繁殖受到限制。此外，熱帶假絲酵母對發(fā)酵產(chǎn)物的適口性有較大影響，不能含量過少。所以確定米曲霉、熱帶假絲酵母、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的最佳接種比例為2∶2∶1∶1。

3.4 接種量的確定（見圖4）

從圖4可以看出，接種量為10%時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量最高，為45.38%，當(dāng)接種量增加為12%時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量未見增長。而當(dāng)接種量為15%時，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量反而降低，原因可能是接種量過大，使菌種生長過快，培養(yǎng)物黏度增加，導(dǎo)致溶氧不足，影響產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的合成。從生產(chǎn)考慮，接種量的減少意味著生產(chǎn)便利和成本的降低，因此應(yīng)該在允許的范圍內(nèi)盡可能降低接種量。本試驗10%和12%接種量對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量影響差異不顯著。從節(jié)約生產(chǎn)成本角度，綜合考慮，選擇10%的接種量最為合適。

3.5 發(fā)酵時間的確定（見圖5）

從圖5可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量呈現(xiàn)先升后將的趨勢，粗蛋白含量最高的發(fā)酵時間是72 h，可達到45.39%；繼續(xù)增加發(fā)酵時間，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量反而降低，且霉味強烈。這是因為在發(fā)酵時間不夠的情況下，菌體生長不完全，發(fā)酵底物沒有被微生物完全分解利用，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量比較低；發(fā)酵時間過長，菌體出現(xiàn)自然溶解現(xiàn)象，使得發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量不高，酸度過大，米曲霉生成大量的孢子使適口性降低，枯草芽孢桿菌生成芽孢，使得粗蛋白含量進一步降低。綜合分析我們選擇最合適的發(fā)酵時間為72 h。

3.6 料水比的確定（見圖6）

水分是微生物所必需的基本物質(zhì)之一，每種微生物都具有最適宜其生長的水分含量，這是因為水是微生物細胞的重要組成部分，是微生物進行代謝活動的介質(zhì)，同時還參與一部分生化反應(yīng)。

從圖6可以看出，隨著料水比的增加，粗蛋白含量先是增加然后逐漸降低，在料水比為1∶3時，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量達到最高為45.13%，繼續(xù)增加料水比，發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量呈降低趨勢。這是因為當(dāng)培養(yǎng)基中含水量偏低時，造成基質(zhì)膨脹度過低，微生物的生長受到抑制，后期由于微生物生長及蒸發(fā)造成發(fā)酵底物較干，微生物難以生長，粗蛋白含量不會很高；當(dāng)培養(yǎng)基中含水量偏高時，會導(dǎo)致基質(zhì)多孔性降低，發(fā)酵物黏度過大，減少基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換，難以通風(fēng)、降溫，微生物生長受到抑制，發(fā)酵產(chǎn)品的粗蛋白含量降低。所以最終選擇料水比為1∶3。

3.7 氮源（尿素）添加量的確定（見表1）

本試驗中的銀杏葉渣其氮含量較低，并且組分多為不溶性的碳水化合物，由于發(fā)酵底物自身原因的限制，在試驗和實際生產(chǎn)中如果不添加一定的氮源，很難滿足微生物生長的需要，同時也無法達到生產(chǎn)蛋白飼料的要求。根據(jù)以往相關(guān)試驗的經(jīng)驗，我們選擇了尿素和硫酸銨分別作為氮源進行對比試驗，每種氮源的添加比例分別為3%、5%、8%、10%和12%。

表1 不同氮源及添加量對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白的影響（%）

由表1我們可以看出，尿素和硫酸銨兩種氮源對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量都能提高，在相同情況下尿素對發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的增幅高于硫酸銨。在尿素添加量為8%時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可達45.69%；在硫酸銨的添加量在12%時，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量可達45.02%。

同時我們還能看出，隨著尿素添入比例的增加，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量，先升高，隨后又有降低的趨勢。歸其原因，在于尿素的添加在一定程度上彌補了發(fā)酵底物中氮含量的不足，促進微生物生產(chǎn)，但是隨著尿素添加量的增加，尿素的利用率下降，未被利用的尿素游離出的銨離子改變了發(fā)酵環(huán)境中pH值，最終影響微生物的正常生長。同時尿素添加量超過8%，發(fā)酵產(chǎn)物含有一定的氨氣味道，隨著添加比例的增加，氣味逐漸變強，嚴重影響牲畜的適口性。在氮源的添加問題上，尿素的添加量要比硫酸銨較少，而且尿素的成本要小于硫酸銨，同時硫酸銨含氮量較低，過量的使用會使硫酸根離子過多，使得培養(yǎng)基偏酸性，這對于發(fā)酵是不利的。所以出于經(jīng)濟效益上、微生物有利生長及發(fā)酵產(chǎn)品適口性三方面的綜合考慮，我們選擇尿素為固體培養(yǎng)基發(fā)酵時添加的唯一氮源，并且添加量為8%。

3.8 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物成分分析

在確定的發(fā)酵工藝下，發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)褐色，濃密狀，有濃郁的醇香味，無霉味，含水量約為10%。測定發(fā)酵產(chǎn)物各成分含量并與原料比較結(jié)果見表2。

表2 發(fā)酵產(chǎn)物成分分析（%）

4 結(jié)論

通過對銀杏葉渣的發(fā)酵工藝條件的研究，最終確定的最佳工藝條件是：熱帶假絲酵母、米曲霉、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的接種比例為2∶2∶1∶1，接種量 10%，添加尿素8%，料水比1：3，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72 h。由發(fā)酵產(chǎn)物檢測結(jié)果可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物的主要營養(yǎng)成分較原料有明顯提高，粗蛋白含量由8.41%提高至45.69%，提高了443.28%，粗脂肪含量由8.74%提高至10.25%，提高了17.28%，粗灰分含量由16.91%提高至23.91%，提高了41.40%，粗多糖含量由2.45%提高至3.67%，提高了49.80%，粗纖維由17.24%降低至8.13%，降低了52.84%。銀杏葉渣經(jīng)固態(tài)發(fā)酵，粗蛋白、粗脂肪、粗多糖等主要成分含量顯著提高，營養(yǎng)價值增加。

該生產(chǎn)工藝解決了林業(yè)產(chǎn)品加工廢棄物銀杏葉渣浪費和對環(huán)境污染的問題，為畜牧業(yè)的發(fā)展提供了新型微生物發(fā)酵蛋白飼料，該工藝簡單易行、便于操作，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟效益，有廣闊的應(yīng)用前景。