揣玉多 馬志剛 王德培

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

丙酸及其鹽是理想的飼料抗真菌劑，我國(guó)作為世界飼料生產(chǎn)大國(guó)，對(duì)丙酸的需求量很大，而我國(guó)丙酸年產(chǎn)量不足200 t，主要依賴進(jìn)口。為解決以上問題，世界各國(guó)科技界和工業(yè)界都在尋找和研究解決的方法，丙酸菌等多菌種聯(lián)合發(fā)酵飼料成為目前較好的解決方法。丙酸菌可代替丙酸用作微生物飼料添加劑解決目前丙酸供需矛盾的問題；又可作為飼料發(fā)酵劑添加菌種之一，充分利用我國(guó)的纖維素資源，將農(nóng)作物秸稈用于微貯飼料，變廢為寶，有效解決養(yǎng)殖業(yè)所需的飼料糧問題。本文旨在研究固定化費(fèi)氏丙酸菌的增菌條件，供上罐發(fā)酵參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

費(fèi)氏丙酸桿菌（P.freudeneichii）的突變株P(guān)f 007，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/l）：蔗糖20，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸銨5，pH值7.2

1.3 方法

1.3.1 固定化菌體的制備

① 菌懸液的制備

取丙酸菌發(fā)酵液200 ml放入離心杯中，18 000 r/min，離心10 min，去除清液，再加入生理鹽水搖勻，然后離心洗滌兩次。加入60 ml無菌水搖勻制成菌懸液。

② 包埋劑的制備

按3%∶3%的比例稱取一定量的聚乙烯醇（PVA）和海藻酸鈉（CA），加入15 ml去離子水加熱融化，攪拌至充分混合，封口，放置到滅菌鍋，于115℃下滅菌20 min。

③ 交聯(lián)劑的制備

配成3%的氯化鈣溶液即為交聯(lián)劑。

④ 固定化凝膠小球的成型

按5 ml菌懸液加入0.6 g麩皮的比例，向菌懸液中加入麩皮，混勻，然后將配好的包埋劑倒入上述混合液中，混勻，利用注射器吸取并滴入3%（w/v）的氯化鈣中。

⑤ 交聯(lián)

完成上述工作后，將該小球交聯(lián)24 h以保證它的強(qiáng)度。交聯(lián)24 h后，用生理鹽水沖洗。然后轉(zhuǎn)到生理鹽水中，放到4℃冰箱保存。

1.3.2 丙酸菌的培養(yǎng)方法

1.3.2.1 斜面種子培養(yǎng)

取一環(huán)菌泥在斜面上劃線接種，于30℃下培養(yǎng)24 h。

1.3.2.2 液體種子培養(yǎng)

由斜面取一環(huán)丙酸菌接種于50 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于250 ml三角瓶，30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.3.2.3 搖瓶發(fā)酵

以1%的接種量將液體種子接入裝有50 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 ml的三角瓶中，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.3 菌體濃度的測(cè)定方法

丙酸菌的活菌計(jì)數(shù)采用平板傾注法。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，保證培養(yǎng)基碳元素、氮元素含量一致設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9（34），

表1 培養(yǎng)基配比L9（34）正交試驗(yàn)因素水平

將正交實(shí)驗(yàn)中的培養(yǎng)基取代搖瓶發(fā)酵中的基本培養(yǎng)基進(jìn)行好氧培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的活菌數(shù)。根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)活菌數(shù)的結(jié)果，方差分析確定較好的培養(yǎng)基配比作為丙酸菌發(fā)酵罐使用的培養(yǎng)基。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以搖瓶發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9（34），如表2：

表2 培養(yǎng)條件L9(34)正交試驗(yàn)因素水平

將實(shí)驗(yàn)中對(duì)應(yīng)條件作相應(yīng)改變，其他條件不變進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，根據(jù)各組實(shí)驗(yàn)活菌數(shù)的結(jié)果，方差分析確定較好的培養(yǎng)條件供上罐發(fā)酵參考。

2 結(jié)果與討論

2.1 增菌培養(yǎng)基條件優(yōu)化

根據(jù)方法1.4節(jié)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3和表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

從表3和表4中可以看出，每個(gè)因素對(duì)菌種增菌都有一定影響，影響因素主次順序是B＞C＞D＞A，即影響最顯著的是氮源，其次是微量元素，而影響最小的是碳源。選取最好水平組合，因素A（碳源）中，水平3（乳酸1.5%+蔗糖0.58%）效果較好；因素B（氮源）中，水平1（酵母膏4.4%）效果較好；因素C（礦物元素）中，水平2（CaCO30.5%）效果較好；因素D（玉米漿）中，水平3（添加1.5%）效果較好，故最佳培養(yǎng)基組合為A3B1C2D3，即培養(yǎng)基配方為：乳酸1.5%，蔗糖0.58%，酵母膏4.4%，CaCO30.5%，玉米漿1.5%。

丙酸菌利用單一糖類作為碳源菌體生長(zhǎng)緩慢，混合底物發(fā)酵的研究顯示，當(dāng)乳酸與其它碳源混合發(fā)酵時(shí)，丙酸菌優(yōu)先利用乳酸，故在設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)時(shí)就選擇了以乳酸為基礎(chǔ)配合其它碳源的混合碳源發(fā)酵，因此碳源因素對(duì)固定化丙酸菌Pf 007的菌體生長(zhǎng)影響不大。

氮源的種類與濃度對(duì)丙酸菌的生長(zhǎng)有重要的影響，蛋白胨、酵母膏等均可作為丙酸菌的較好的氮源，但對(duì)無機(jī)氮源的研究應(yīng)用比較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酵母膏是固定化丙酸菌Pf 007較好的氮源。

據(jù)報(bào)道 Co2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等二價(jià)離子對(duì)丙酸菌的生長(zhǎng)均有積極的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CaCO3是較好的礦物元素添加劑，不僅能補(bǔ)充丙酸菌生長(zhǎng)所需的Ca2+，還能緩沖由于產(chǎn)酸形成的pH值劇降，從而有效的減緩由發(fā)酵液產(chǎn)酸對(duì)固定化丙酸菌Pf 007菌體生長(zhǎng)的抑制。

玉米漿價(jià)格低廉，在工業(yè)化生產(chǎn)中，它不僅能作為氮源還能提供多種生長(zhǎng)因子，因此在本實(shí)驗(yàn)中添加了部分玉米漿，更有利于固定化丙酸菌Pf 007的菌體生長(zhǎng)。

2.2 增菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

采用2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)中確定的最佳培養(yǎng)基組合，根據(jù)方法1.5進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5和表6。

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表6 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

從表5和表6中可以看出，每個(gè)因素對(duì)菌種增菌都有很大的影響，影響因素主次順序是A＞D＞B＞C，即影響特別顯著的是裝液量，其次是發(fā)酵溫度，再次是接種量，而影響最小的是初始pH值。選取最好水平組合，因素A（裝液量）中，水平1（25 ml）效果較好；因素B（接種量）中，水平2（3%）效果較好；因素C（初始pH值）中，水平3（7.6）效果較好；因素D（發(fā)酵溫度）中，水平3（35℃）效果較好，故最佳培養(yǎng)條件為A1B2C3D3，即裝液量為250 ml三角瓶裝液25 ml，3%接種量，培養(yǎng)基初始pH值7.6，發(fā)酵溫度35℃。

搖瓶發(fā)酵所需要的氧是由表面通氣供給的，通氣狀況是由裝液量和搖床轉(zhuǎn)速?zèng)Q定的。裝液量過多會(huì)導(dǎo)致供氧不足，而過少的裝液量則不利于菌體的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)是通過裝液量的不同間接控制菌種發(fā)酵的通氧量，從而控制菌種的生長(zhǎng)。結(jié)果顯示，裝液量對(duì)固定化丙酸菌Pf 007的菌體濃度有極為顯著影響，裝液量越少，即通氧量越大，菌體生長(zhǎng)越旺盛；而溫度是影響固定化丙酸菌Pf 007菌體濃度的另一個(gè)顯著因素，溫度越高，菌體生長(zhǎng)速度越快，發(fā)酵周期越短，但溫度過高也會(huì)給實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用帶來很多問題；接種量是影響固定化丙酸菌Pf 007菌體濃度的另一重要因素，接種量過少，則菌體延滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)；反之，接種量過大，雖然可使菌體快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但過量的菌體會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗而阻礙菌體數(shù)量的增加。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)固定化丙酸菌Pf 007菌體濃度影響不大，說明此突變株對(duì)此條件不敏感。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

綜上所述，固定化丙酸菌Pf 007在搖瓶培養(yǎng)條件下最佳增菌條件控制如下：

①發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：乳酸15，蔗糖5.8，酵母膏44，CaCO35，玉米漿15，pH值7.6；

②發(fā)酵條件：3%接種量，裝液量為250 ml三角瓶裝液25 ml，發(fā)酵溫度35℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。

采用以上最佳發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，固定化丙酸菌Pf 007在發(fā)酵液中的活菌數(shù)為8.1×1010cfu/ml，較優(yōu)化前3.0×1010cfu/ml的提高62%，效果顯著。

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）