成莉鳳，馮湘沅，劉正初，段盛文，鄭科，鄭霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙410205)

果膠酶是指能分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱。根據(jù)底物及作用方式不同，果膠酶主要分為果膠裂解酶 (PG)、果膠解聚酶 (PL)和果膠酯酶 (PE)。不同果膠酶組分的應(yīng)用側(cè)重的領(lǐng)域不同，果膠裂解酶多用于紡織工業(yè)的麻類生物脫膠、棉生物精煉等［1］;果膠解聚酶多用于植物病毒的純化、紙漿漂白、醫(yī)藥原料提取等 ;果膠酯酶多用于食品工業(yè)的果汁橙清、咖啡發(fā)酵等［4］。

果膠酶作為非纖維素降解的復(fù)合酶系關(guān)鍵組分之一，引起了麻類生物脫膠專家的高度關(guān)注，但國(guó)內(nèi)外有關(guān)草本纖維生物提取清潔生產(chǎn)酶制劑的研究報(bào)道很少，只有通過深入研究草本纖維生物提取工藝中非纖維素降解的本質(zhì)，才能為高效利用草本纖維資源的生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展提供有效途徑［5，6］。中國(guó)農(nóng)科院麻類研究所工程酶項(xiàng)目組用草本纖維原料富集培養(yǎng)篩選到3株具有高效的非纖維素降解功能的菌株P(guān)1、P2和P3，本研究擬選取這3個(gè)菌株作為研究材料，系統(tǒng)分析其表達(dá)的果膠酶組分和測(cè)定其酶活力大小，為進(jìn)一步開發(fā)菌株的新用途和探討草本植物非纖維素生物降解機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

菌株P(guān)1、P2和P3由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所工程酶項(xiàng)目組選育并保藏。

1.2 主要試劑和儀器

聚半乳糖醛酸鈉 (No.P3850，Sigma)、橘子果膠 (No.P9561，Sigma)。酶標(biāo)儀 (Thermo，美國(guó))、冷凍離心機(jī) (Sigma，德國(guó))、便攜式 pH計(jì) (HANNA，Romania)、電子天平 (METTLER TOLEDO，瑞典)、超聲波破碎儀 (Branson，美國(guó))。

1.3 培養(yǎng)基

選擇培養(yǎng)基:橘子果膠0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.2%，NaCl 0.5%，瓊脂粉0.2%。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%，牛肉膏0.5%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%。配置固體培養(yǎng)基，需要添加2%瓊脂粉［7］。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨1.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.2%，NaCl 0.35%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%［8］。

1.4 菌種培養(yǎng)方法

從本項(xiàng)目組保藏的斜面菌苔挑取一環(huán)菌種接種至5.0 mL種子培養(yǎng)基，充分混勻，35°C靜置培養(yǎng)5.0－6.0 h。稀釋后涂布于種子培養(yǎng)基平板，35°C靜置培養(yǎng)18－20 h，分離單菌落。挑選典型菌落接種于5.0 mL種子培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)5 h;接種到含100 mL種子培養(yǎng)基的小三角瓶，35°C、180 r/min培養(yǎng)6 h;按2%接種量接種含300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶，35°C、180 r/min培養(yǎng)18－20 h，即為成熟發(fā)酵液。

1.5 粗酶液制備

取成熟的發(fā)酵液50 mL，3000 r/min，4°C條件下離心10 min，收集上清液即為胞外酶液。分別用50 mL預(yù)冷的生理鹽水洗滌菌體兩次，并用等量的緩沖溶液重懸菌體，將菌懸液在4°C條件下用超聲波破碎儀裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，10000 r/min，4°C條件下離心10 min，上清液即為胞內(nèi)酶液。

超聲參數(shù)設(shè)置:強(qiáng)度30%，超聲5 s，間隔5 s，時(shí)間分別設(shè)為20 min、25 min、30 min、35 min和40 min。以果膠解聚酶作參考，分析酶活變化，確定最佳的菌體超聲破壁時(shí)間［9］。

1.6 果膠酶活力測(cè)定

1.6.1 果膠解聚酶活力測(cè)定

用pH 9.0的0.05 mol/L甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液配置5.0 mg/mL的聚半乳糖醛酸鈉溶液。取2.0 mL底物預(yù)熱至50°C，添加1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，立即加入2.0 mL DNS。沸水浴中顯色2.0 min，冰水浴迅速冷卻，加ddH2O定容至15 mL。以煮沸滅活的相同酶液，做相同反應(yīng)為陰性對(duì)照，測(cè)定樣品的OD520［10］。果膠解聚酶活力定義為:底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1.0 μmol半乳糖醛酸的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，以IU表示。

1.6.2 果膠裂解酶活力測(cè)定

用pH 9.0的0.05 mol/L甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液配置5.0 mg/mL的聚半乳糖醛酸鈉溶液。取2.0 mL底物預(yù)熱到50°C，添加1.0 mL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液和6.0 μL 1.0 mol/LCaCl2溶液，充分混勻，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，煮沸滅活。用沸水浴充分滅活的酶液，作相同反應(yīng)處理的溶液為對(duì)照，測(cè)定OD235。果膠裂解酶定義為:底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1.0 μmol不飽和半乳糖醛酸酐所需的酶量為1個(gè)酶活力單位 (以IU表示)，235 nm波長(zhǎng)下消光系數(shù)為4600/(M·cm)。

1.6.3 果膠酯酶活力測(cè)定

用pH 6.0檸檬酸－Na2HPO4緩沖液配置5.0 mg/mL的橘子果膠 (DE≥85%)溶液。取10 mL 0.5%果膠溶液，40°C水浴平衡5.0 min，加入2.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40°C保溫30 min后，煮沸終止反應(yīng)，用0.02 mol/L NaOH滴定產(chǎn)生的羧基基團(tuán)。以煮沸滅活的酶液做相同的處理作陰性對(duì)照。酶活力單位定義為:底物每分鐘釋放出1.0 μmol羧酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位 (以IU表示)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖表制作及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠解聚酶活力比較

對(duì)3個(gè)菌株進(jìn)行超聲波破壁時(shí)間進(jìn)行選擇，結(jié)果 (圖1)表明:3個(gè)菌株測(cè)得的胞內(nèi)果膠裂解酶的相對(duì)酶活力均是隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，當(dāng)超聲到一定時(shí)間后基本穩(wěn)定。超聲破碎細(xì)胞的原理主要與空化效應(yīng)有關(guān)。在一定的時(shí)間內(nèi)，空化作用持續(xù)，細(xì)胞破碎數(shù)目快速增長(zhǎng)。當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，大部分細(xì)胞已經(jīng)破碎，再延長(zhǎng)超聲時(shí)間，則相對(duì)酶活變化不大。從酶活力回收和能耗考慮，P1、P2和P3菌體的超聲時(shí)間選擇分別設(shè)為:35 min、40 min和40 min，其余超聲參數(shù)相同。

圖1 菌體細(xì)胞破壁時(shí)間與胞內(nèi)酶活力關(guān)系Fig.1 Relationship between ultrasonic cell wall－breaking time and intracellular enzyme activity

通過DNS法測(cè)定果膠解聚酶活力，結(jié)果 (表1)顯示:(1)菌株P(guān)1表達(dá)的胞外果膠解聚酶活力最高，達(dá)71.66 IU/mL，是其胞內(nèi)酶的7倍;(2)菌株P(guān)2表達(dá)的果膠解聚酶活力最低，胞內(nèi)酶和胞外酶活力均不大于10 IU/mL;(3)菌株P(guān)3表達(dá)的胞內(nèi)果膠解聚酶活力為39.09 IU/mL，是胞外果膠解聚酶的3倍左右。因此，在測(cè)定的3個(gè)菌株中，菌株P(guān)1表達(dá)胞外果膠裂解酶酶活力最高，便于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

表1 不同菌株產(chǎn)生的果膠解聚酶活力Tab.1 Polygalacturonase activities produced from different strains

2.2 果膠裂解酶活力比較

通過C=C光吸收法測(cè)定果膠裂解酶活力，結(jié)果 (圖2)顯示:(1)菌株P(guān)3表達(dá)的果膠裂解酶活力為210.7 IU/mL，并且胞內(nèi)酶活力遠(yuǎn)大于胞外酶活力;(2)菌株P(guān)2表達(dá)的胞內(nèi)果膠裂解酶活力和胞外酶活力相當(dāng);(3)菌株P(guān)3表達(dá)的胞內(nèi)果膠解聚酶活力最低，胞外酶活力和胞內(nèi)酶活力均小于50 IU/mL。因此，在測(cè)定的3個(gè)菌株中，菌株P(guān)3表達(dá)果膠裂解酶總酶活力最高，具有明顯優(yōu)勢(shì)。

圖2 不同菌株產(chǎn)生的果膠裂解酶活力Fig.2 Pectin lyase activities produced from different strains

2.3 果膠酯酶活力比較

通過酸堿滴定法測(cè)定果膠酯酶活力，結(jié)果 (圖3)顯示:(1)菌株P(guān)2表達(dá)的胞外果膠酯酶活力為76.7 IU/mL，并且是其胞內(nèi)酶活力的2倍左右;(2)菌株P(guān)1表達(dá)的胞外果膠酯酶活力約為20 IU/mL，也是胞內(nèi)酶活力的2倍;(3)菌株P(guān)3表達(dá)的胞內(nèi)果膠解聚酶活力和胞外酶活力均小于10 IU/mL。因此，在測(cè)定的3個(gè)菌株中，菌株P(guān)2表達(dá)果膠裂解酶胞內(nèi)活力和胞外酶活力均為最高。

圖3 不同菌株產(chǎn)生的果膠酯酶活力Fig.3 Pectinesterase activities produced from different strains

3 討論

本文通過DNS法、C=C光吸收法和酸堿滴定法對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)的果膠酶進(jìn)行組分分析和酶活力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株表達(dá)的果膠酶組分多，均包含了果膠解聚酶、果膠裂解酶和果膠酯酶。據(jù)國(guó)內(nèi)外的報(bào)道，果膠種類繁多，其徹底降解需要果膠裂解酶、果膠水解酶、果膠酯酶等一系列酶的協(xié)同作用［11，12］。本研究的出發(fā)菌株具有降解草本纖維非纖維素能力可能與其表達(dá)的果膠酶組分全面有關(guān)，在后續(xù)進(jìn)一步探討草本植物非纖維素生物降解機(jī)理的研究中，果膠酶作為重點(diǎn)課題之一值得關(guān)注。

據(jù)報(bào)道，蘭穎輝［13］對(duì)黑曲霉產(chǎn)果膠酶不同組分的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，其聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和果膠酯酶分別提高到523.7 U/mL、8.47 U/mL和76.7 U/mL。在目標(biāo)菌株P(guān)3的培養(yǎng)基添加不同的誘導(dǎo)物，其產(chǎn)生的果膠裂解酶 (210.7 IU/mL)、果膠解聚酶 (39.1 IU/mL)和果膠酯酶 (2.17 IU/mL)也有可能進(jìn)一步提高。

本文系統(tǒng)比較了同一菌株表達(dá)3種果膠酶組分的胞內(nèi)酶和胞外酶活力，其相對(duì)大小各異，沒有統(tǒng)一規(guī)律。菌株P(guān)1的三種果膠酶組分均是胞外酶活力大于胞內(nèi)酶活力，菌株P(guān)2的胞外果膠酯酶大于胞內(nèi)果膠酯酶，其余兩種組分的胞外酶活力與胞外酶活力相當(dāng)，而菌株P(guān)3的果膠裂解酶和果膠解聚酶均是胞內(nèi)酶活力大于胞外酶活力。從基因的角度分析，到底是胞內(nèi)表達(dá)還是胞外表達(dá)可能與編碼該酶的基因是否帶有信號(hào)肽有關(guān)［14］。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，一般會(huì)優(yōu)先考慮胞外酶，因?yàn)榘饷阜蛛x純化成本低、蛋白質(zhì)容易正確折疊、修飾等，而胞內(nèi)酶分離還需要微生物細(xì)胞破壁破膜，增加工藝的復(fù)雜性。有些胞內(nèi)酶不能正確折疊和修飾，還會(huì)形成包涵體，即使純化出來也不一定能成功復(fù)性［15］。從生產(chǎn)應(yīng)用的角度來看，菌株P(guān)1還可以通過合適的培養(yǎng)基誘導(dǎo)，大大提高其分泌的三種果膠酶活力，從而達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的要求。菌株P(guān)3表達(dá)的果膠酯酶在降解高度酯化果膠的效果方面值得進(jìn)一步研究，有望投入到食品加工業(yè)［16］。

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