缺氧誘導因子1α在肢端惡性黑素瘤組織中的表達

周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

缺氧誘導因子1α在肢端惡性黑素瘤組織中的表達

周璐 胡彬 黃瑩雪 邵雪寶 李阿梅 陳浩 孫建方

目的探討缺氧誘導因子(HIF)1α在肢端惡性黑素瘤(MM)中的表達及其與干細胞因子(SCF)/c-kit途徑的關系。方法應用免疫組化法檢測HIF-1α在93例MM、21例非肢端MM、39例肢端色素痣組織中的表達，并用15例肢端正常皮膚組織作對照。同時檢測c-kit在93例肢端MM組織中的表達情況，采用Spearman相關分析，分析其與HIF-1α的相關性。結果在93例肢端MM中，81例(87.10%)陽性表達HIF-1α，在21例非肢端MM中19例(90.48%)陽性，39例肢端色素痣中6例(15.38%)陽性；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚和肢端色素痣相比較，肢端MM中HIF-1α的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)；在肢端MM和非肢端MM組間，HIF-1α表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。HIF-1α表達水平與黑素瘤Clark分級、Breslow厚度分級均呈正相關(rs=0.442，P＜0.01；rs=0.368，P＜0.01)。在原位、侵襲性、轉移性肢端MM組織中，HIF-1α表達水平與腫瘤進展呈正相關(rs=0.420，P＜0.01)。在肢端MM中，HIF-1α表達與c-kit表達呈正相關(rs=0.307，P＜0.01)。結論HIF-1α蛋白在肢端MM中呈高表達，且與腫瘤的分期、進展、侵襲性均呈正相關，與c-kit在肢端MM組織中的協(xié)同表達，提示可能共同參與肢端MM的發(fā)病機制。

黑色素瘤；缺氧誘導因子1，α亞基；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit

皮膚惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，致死率高，研究發(fā)現(xiàn)不同的人種中黑素瘤的發(fā)生率、臨床表現(xiàn)、組織學亞型和基因改變不盡相同，亞洲人種以肢端黑素瘤為主，而腫瘤位于肢端，提示其發(fā)生可能與肢端的缺氧微環(huán)境相關。眾所周知，組織缺氧是腫瘤微環(huán)境基本特征之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關，缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1α是腫瘤缺氧反應中關鍵性因子，既往文獻報道其在多種腫瘤中表達升高，與其中某些腫瘤的惡性程度及患者死亡率明顯相關[1-4]。在乳腺癌及胰腺癌中發(fā)現(xiàn)HIF-1α和干細胞因子(stem cell factor，SCF)通過SCF/c-kit途徑誘導腫瘤血管生成及侵襲性增加[5-6]，而在黑素瘤中的相關研究報道較少[2，7]。我們推測在肢端黑素瘤中，可能存在低氧狀態(tài)誘導HIF-1α高表達及SCF/c-kit途徑的異?；罨瑸檫M一步探討HIF-1α在肢端黑素瘤發(fā)病機制中的作用及其與SCF/c-kit途徑的聯(lián)系，我們選擇肢端MM組織，觀察皮損中HIF-1α、c-kit的表達。

資料與方法

1.標本:收集2010年1月至2013年6月期間在中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床及病理證實的肢端MM 93例，非肢端MM 21例，肢端色素痣39例，肢端正常皮膚組織15例。93例肢端MM患者中，女56例，男37例；發(fā)病年齡29～90歲，平均年齡59.94歲；原位腫瘤28例，侵襲性腫瘤58例，轉移性MM 7例；Clark分級Ⅰ～Ⅱ級38例，Ⅲ～Ⅴ級55例。21例非肢端MM患者中，女10例，男11例；發(fā)病年齡24～87歲，平均年齡62.99歲；原位腫瘤5例，侵襲性腫瘤16例；ClarkⅠ～Ⅱ級6例，Ⅲ～Ⅴ級15例。肢端色素痣39例，其中發(fā)育不良痣5例，普通良性痣34例。

2.標本處理:所有標本經(jīng)4%甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋；4 μm厚度切片后常規(guī)HE染色或敷貼于10%多聚賴氨酸預先處理的載玻片上，用于免疫組化實驗。

3.試劑及儀器:鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(ab1)產(chǎn)自英國Abcam公司(工作濃度為1∶100)，即用型鼠抗人c-kit單克隆抗體、即用型羊抗鼠二抗、3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒均產(chǎn)自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。顯微鏡工作臺及照相系統(tǒng)為日本Nikon公司產(chǎn)品。

4.免疫組化法:石蠟切片脫蠟脫水；Tris-EDTA緩沖液(0.01 mol/L，pH9.0)高溫高壓修復 3 min，室溫自然冷卻；后分別滴加抗HIF-1α抗體和抗c-kit抗體(其中抗c-kit抗體只在肢端MM組織切片中滴加)；濕盒中4℃過夜；再滴加二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。用PBS代替一抗作陰性對照，用人卵巢鱗狀上皮細胞癌作HIF-1α染色陽性對照，用肥大細胞瘤作c-kit陽性對照。所有組織染色條件相同。

5.結果判定:判定標準:腫瘤細胞核呈棕褐色顆粒著色為陽性細胞。高倍鏡下(×400)隨機選擇5個視野，計數(shù)全部有核細胞，分別計算切片中著色強度和著色陽性細胞的百分率。著色強度:強著色為3分，中等著色為2分，弱著色為1分，不著色或著色不清為0分；著色陽性細胞的百分率＞50%為3分，10%～50%為2分，＜10%為1分，不著色為0分，最后將所計的分數(shù)相乘得出最終的免疫組化積分。組化積分0～1分為(-)，2～3分為(+)，4～6分為(++)，＞6分為(+++)[8]。結果判定由2名皮膚病理醫(yī)生獨立進行。

6.統(tǒng)計學分析:應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗；HIF-1α和腫瘤進展、腫瘤分級及c-kit蛋白間相關性研究用Spearman相關檢驗。檢驗水準α均為0.05。

結 果

圖1 缺氧誘導因子(HIF)1α和c-kit在肢端侵襲性黑素瘤中的表達(DAB染色×200) 1a:HIF-1α染色；1b:c-kit染色 圖2 HIF-1α在良性色素痣中的陰性表達(DAB染色×100) 真皮淺層痣細胞成巢區(qū)域分布較多色素顆粒

1.HIF-1α蛋白的表達:免疫組化結果顯示(圖1a)，在93例肢端MM中，陽性表達81例(87.10%)。21例非肢端 MM中，19例陽性(90.48%)；其中，5例原位腫瘤中3例陽性；16例侵襲性腫瘤中7例陽性(43.75%)。在39例色素痣(圖2)中6例陽性(15.38%)；15例肢端正常皮膚均為陰性。與肢端正常皮膚組和肢端色素痣組比較，肢端MM組中HIF-1α的蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=52.258，62.889，均P＜ 0.01)；在侵襲性MM中，肢端組中HIF-1α的蛋白表達水平顯著高于非肢端組，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=24.081，P＜0.01)，在原位MM中，兩組的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.118，P＞0.05)。

2.HIF-1α蛋白表達與肢端MM患者臨床特征及腫瘤侵襲和轉移的關系(表1):93例肢端MM中，HIF-1α表達水平在Clark分級Ⅰ～Ⅱ級組與Ⅲ～Ⅴ級組間、有/無潰瘍組間差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，而在不同性別組間、Breslow厚度0～2 mm組與厚度＞2 mm組間、有/無炎細胞浸潤組間差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。在原發(fā)、侵襲性、轉移性肢端MM組織中，HIF-1α表達水平與腫瘤進展呈正相關(rs=0.420，P＜ 0.01)；HIF-1α 表達水平與腫瘤Clark分級、Breslow厚度分級均呈正相關(rs=0.442，P＜ 0.01；rs=0.368，P＜ 0.01)。

3.肢端MM中HIF-1α蛋白與c-kit表達的相關性(表2):93例肢端MM中，84例表達c-kit，其中 42例(圖 1b)(+++)，33例(++)，9例(+)，9例不表達；經(jīng)Spearman相關分析，HIF-1α與c-kit表達呈正相關(rs=0.307，P＜ 0.01)。

討 論

皮膚MM發(fā)生于人體的最外層組織，即距離中心循環(huán)系統(tǒng)最遠、相對缺氧的皮膚組織內(nèi)[9]，而肢端皮膚缺氧程度較其他部位皮膚更甚，提示缺氧在肢端皮膚黑素瘤的發(fā)生中可能起到一定作用。

表1 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中缺氧誘導因子1α表達與臨床特征的關系

亞洲人種以肢端MM為主，提示其發(fā)生可能與肢端的缺氧微環(huán)境相關。缺氧可以促進腫瘤的生長、侵襲和轉移，且影響患者預后。腫瘤對缺氧的反應主要通過轉錄調(diào)節(jié)HIF-1α的水平來實現(xiàn)[1]。HIF-1α調(diào)節(jié)細胞對氧壓力的適應性，影響腫瘤細胞的重塑、代謝、增殖、存活、侵襲、凋亡及血管形成中等相關基因的表達[1-2，10]。HIF-1α在乳腺癌、腸癌、前列腺癌、肺癌等腫瘤均有高表達，且與腫瘤的惡性進展相關[2-3，11]。此外，研究亦發(fā)現(xiàn)HIF-1α還可誘導腫瘤對治療的抵抗，減弱機體抗腫瘤的適應性免疫，而HIF-1α表達越高，患者預后及對治療的反應越差[12-13]。以上研究均提示HIF-1α在腫瘤形成和進展中有重要的作用，為腫瘤的治療同樣提供了新的靶點。

表2 肢端皮膚惡性黑素瘤組織中HIF-1α表達與腫瘤進展、分期及c-kit表達間的相關分析

缺氧條件下，腫瘤內(nèi)HIF-1α蛋白水平升高，一方面，其可與SCF啟動子中功能性缺氧反應元件(hypoxia-response element，HRE)區(qū)域相結合，從而活化SCF及其受體c-kit，激活下游PI3K/Akt通路，引起腫瘤細胞的增殖、血管形成，并增加侵襲相關基因的表達[6，14]。 另一方面，Monsel等[7]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α還可使含有突變型c-Kit基因的黑素瘤細胞增殖活化，亦能激活下游PI3K/Akt通路，激活腫瘤的一系列生物學行為。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肢端MM中，HIF-1α蛋白的表達水平明顯高于肢端良性色素痣，且與腫瘤的分期、進展、侵襲性均呈正相關，提示HIF-1α在肢端MM組織中高表達，可能參與肢端MM的發(fā)病機制；在侵襲性腫瘤中，肢端MM中HIF-1α蛋白的表達高于非肢端MM，提示肢端部位腫瘤進展和缺氧微環(huán)境的關系較非肢端部位的腫瘤更密切。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在肢端MM中，HIF-1α與c-kit蛋白表達水平呈正相關，進一步佐證了HIF-1α與c-kit基因的表達在誘導黑素瘤細胞活化、增殖等方面具有協(xié)同作用。目前，關于HIF-1α在腫瘤，特別是肢端MM發(fā)病機制方面的研究仍較廣泛，具體機制尚不明確，提示可能通過多條途徑影響腫瘤的發(fā)病過程。而HIF-1α與c-kit在肢端MM組織中的協(xié)同表達，提示在抗腫瘤治療中，也許可以聯(lián)合應用HIF-1α與c-kit的拮抗劑，從而為黑素瘤的治療提供新的治療策略。

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2014-01-17)

(本文編輯:尚淑賢)

Expression of hypoxia-inducible factor-1α in acral malignant melanoma tissue

Zhou Lu，Hu Bin，Huang Yingxue，Shao Xuebao，Li Amei，Chen Hao，Sun Jianfang*.*Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s：Chen Hao，Email：ch76ch@163.com；Sun Jianfang，Email：sunjf57@163.com

ObjectiveTo measure the expression of hypoxia-inducible factor(HIF)-1α in acral malignant melanoma(MM)tissue and to investigate its relationship with the stem cell factor(SCF)/c-kit pathway.MethodsImmunohistochemical staining was performed to measure the expression of HIF-1α in tissue specimens from lesions of 93 patients with acral MM，21 with non-acral MM，39 with acral melanocytic nevi，and from the normal acral skin of 15 healthy human controls.Meanwhile，the expression of c-kit was detected by immunohistochemical staining in the 93 acral MM tissue specimens.Statistical comparisons were carried out by chi-square test and Mann-WhitneyUtest.The relationship of HIF-1α expression with c-kit expression as well as tumor progression and staging was assessed by Spearman correlation analysis.ResultsImmunohistochemistry showed that the expression rate of HIF-1α was 87.10%(81/93)in acral MM specimens，90.48%(19/21)in non-acral MM specimens，15.38%(6/39)in acral melanocytic nevus specimens，but 0(0/15)in the normal acral skin specimens.The expression of HIF-1α was significantly higher in acral MM lesions than in normal acral skin and acral melanocytic nevus lesions(bothP＜0.01)，and significantly different between acral MM and non-acral MM lesions(P＜ 0.01).Moreover，HIF-1α expression was positively correlated with Clark level and Breslow depth of melanoma(rs=0.442，0.368，respectively，bothP＜ 0.01)，with the progression of acral MM(fromin situto aggressive and metastatic MM)(rs=0.420，P＜ 0.01)，and with the expression of c-kit(rs=0.307，P＜ 0.01).Conclusions HIF-1α is highly expressed in acral MM，positively correlated with the staging，progression and aggression of MM，and co-expressed with c-kit in acral MM tissue，suggesting that both HIF-1α and c-kit take part in the pathogenesis of acral MM.

Melanoma；Hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.002

國家自然科學基金(81102067)

210042南京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所[周璐(現(xiàn)在青島大學附屬醫(yī)院皮膚科，266000)、胡彬、黃瑩雪、邵雪寶、李阿梅、陳浩、孫建方]

陳浩，Email:ch76ch@163.com；孫建方，Email:sunjf57@163.com