間充質(zhì)干細胞臨床應用的安全性問題

武艷++++++曹雅男++++++劉潔婷++++++袁曉環(huán)++++++騰云

[摘要] 間充質(zhì)干細胞是干細胞家族的重要成員，起源于中胚層和外胚層，因其具有易分離、趨化性、免疫調(diào)節(jié)作用、多向分化潛能等生物學特性而日益受到人們的關(guān)注，并成為細胞療法中治療各種難治性疾病的熱門種子細胞，然而細胞療法所涉及的潛在風險還不確定。本文就間充質(zhì)干細胞應用所涉及的安全性問題作綜述，并強調(diào)建立規(guī)范化的應用標準更有利于細胞產(chǎn)品在臨床上的應用和推廣，給廣大患者帶來真正的福音。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細胞；細胞療法；安全性

[中圖分類號] R457.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）11（b）-0190-03

細胞療法近年來已成為治療多種疾病的新策略，其目的是替代修復或加強受損組織和器官的生物學功能。隨著干細胞生物學與再生醫(yī)學研究的深入，人們對于其生物學特性及潛在的臨床應用認識逐漸加深，使之成為細胞療法中應用最多的靶細胞[1-3]。隨著對間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）認識的逐步深入，其自身的優(yōu)越性逐漸顯露出來，將成為細胞替代治療的理想種子細胞。對于MSCs研究的某些成果已開始應用于臨床，有一些雖然暫時未能在臨床上開展，但也為有些疾病的臨床治療提供了新的治療角度和思路。對于MSCs治療作用的評估最開始是在再生醫(yī)學的應用上，MSCs已經(jīng)顯示出具有直接調(diào)節(jié)先天性與適應性免疫系統(tǒng)的作用[4]、促進上皮細胞增殖[5]、促進缺血性組織的血管再生等等[6]，MSCs的這些特性發(fā)現(xiàn)開啟了MSCs移植治療免疫性、組織損傷性等疾病的新紀元。

近年來，對一些難治性疾病采用MSCs移植治療已經(jīng)得到美國食品和藥物管理局（US-FDA）的批準，包括心肌梗死、腦卒中、半月板損傷、移植物抗宿主病及自身免疫紊亂性疾病等[7]。盡管在過去的十幾年中，臨床試驗很少發(fā)現(xiàn)MSCs移植會產(chǎn)生不利的影響，但在動物實驗則發(fā)現(xiàn)可能存在較短時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)潛在性的危害，本文將MSCs移植涉及的安全性問題作總結(jié)。

MSCs移植方法的過程包括細胞的采集、分離、培養(yǎng)、純化以及細胞移植到患者體內(nèi)。臨床應用干細胞治療疾病最重要的前提之一就是必須保證細胞產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，其中質(zhì)量可控性是安全性和有效性的基礎(chǔ)和保證。那么，如何保證用于臨床的干細胞是安全、有效，并保證質(zhì)量可控呢？對于這些細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和移植有可靠的履行規(guī)則嗎？目前，在歐洲國家已經(jīng)開始提出使用臨床級的MSCs產(chǎn)品，并且開始制訂包括無菌、細胞活力和染色體表型等的各種質(zhì)控標準。細胞治療的過程非常復雜，有許多基本的生物學問題需要弄清楚。事實上，MSCs移植的應用不僅面臨其他細胞療法共同的安全性問題，也面臨其所獨有的問題。

1 細胞的分離、培養(yǎng)和純化

雖然來源于骨髓比來源于其他組織的MSCs的數(shù)量相對更多，但MSCs的數(shù)量僅占骨髓總量的0.001%～0.01%[8]，很難滿足臨床細胞治療的需要，因此需要培育大量的MSCs來滿足其應用，但在MSCs的分離、培養(yǎng)、細胞增殖傳代的過程中有許多問題需要考慮。

干細胞組織來源多樣，供者的既往病史、家族史、性別、年齡、血型、組織相容性抗原等遺傳背景都需要考慮。在進行自體移植收集細胞的時候，也需要對患者的整體狀況作評估。提取細胞的手術(shù)可能會損傷患有感染、腎臟疾病、心包積液等禁忌證患者的健康。對于細胞產(chǎn)品本身來說，確保其無菌狀態(tài)是細胞療法的一個首要問題，因為細胞產(chǎn)品不能像其他藥品那樣有一個終端滅菌消毒的過程，因此全程操作必須在無菌條件下進行[9]。在收集細胞之前，所有的腸道外用藥和醫(yī)療器械都需高溫消毒，一次性物品也要進行消毒處理，并行有氧和厭氧菌及真菌微生物檢測，以保證細胞無菌且不會給患者帶來傷害。

另外，培養(yǎng)條件對于維持細胞的特性也非常重要。細胞的體外分離、培養(yǎng)、擴增和細胞制品制備過程的漫長且需要加入血清、抗生素、生長因子、抗體、膠原酶、蛋白酶等物質(zhì)，外來物質(zhì)的污染也不可避免，在此過程中，以加入的血清為例，目前細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要加入10%～20%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS或fetal calf serum，F(xiàn)CS），雖然FBS或FCS似乎是獲得高質(zhì)量MSCs必不可少的，但其能帶來潛在的危險，甚至在移植入患者體內(nèi)后引起免疫反應[10-11]，包括傳播具有免疫原性的異種蛋白和致病原等[12]，而使MSCs移植的療效大大降低[13]。因此，在細胞培養(yǎng)過程中，尋找FBS/FCS的替代物或采用無血清培養(yǎng)，取消非人產(chǎn)品的使用來降低潛在的風險是有必要的[14]。Doucet等[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)MSCs時，采用血小板血漿培養(yǎng)細胞維持MSCs分化能力比FCS的效果更好。其他外來因素包括細菌、支原體、病毒等也會影響細胞產(chǎn)品的應用。對于病毒來說，最主要的來源是供體的骨髓，因此對于供體的血清學檢測分析是否存在人類免疫缺陷病毒、人類T淋巴細胞病毒、肝炎病毒等非常必要[16]。另外還有一個重要的問題需要注意，許多病毒的潛伏期很長，這也就意味著其潛在的風險在整個過程中無法完全消除。

在體外的操作過程中，細胞的特性包括生物學功能、端粒酶、核型、組織相容性抗原、原癌抑癌基因、增殖能力、分化潛能等可能發(fā)生改變并帶來免疫毒性和致瘤風險。細胞培養(yǎng)、保存、運輸、復蘇、配制的過程時間較長，細胞制品的存活率、生物學功能、均一性無時不在變化，難以保證MSCs臨床應用的安全、有效，甚至在MSCs的早期傳代細胞也會發(fā)生染色體異常[17]，這就意味著在MSCs移植之前其特性應被監(jiān)測以保證應用的安全性。

2 細胞的貯存

一般來說，制備最終細胞產(chǎn)品在應用之前都是冷藏貯存在細胞庫中。細胞產(chǎn)品的半衰期很短[18]，許多細胞制品在給患者移植之前其效能就已經(jīng)發(fā)生了變化，因此這需要考慮細胞的一致性和細胞的穩(wěn)定性。對于細胞的一致性來說，干細胞受不同供體的影響，包括年齡、性別、身體狀況等，細胞的來源不同，細胞的增長率、細胞的分化能力、染色體的穩(wěn)定性、移植入體內(nèi)的活性等也會不同[19]，如供體的年齡較大，則MSCs老化會更快，其生物學活性也會較差。每一批次來源于不用供體的細胞在治療時也應考慮人類白細胞抗原的配型，因為異源細胞移植最大的障礙就是免疫排斥現(xiàn)象。細胞穩(wěn)定性也是需要注意的問題，細胞產(chǎn)品不同于傳統(tǒng)藥物，因為其是一種“活的”物質(zhì)，受到來源、培養(yǎng)過程及貯存的限制，所以在細胞移植之前需要檢測細胞的穩(wěn)定性包括關(guān)鍵基因的表達、染色體的穩(wěn)定性和表觀遺傳學的穩(wěn)定性（甲基化、miRNA、組蛋白乙?；蚗染色體的失活）等。endprint

3 細胞的移植

一般來說細胞移植主要包括兩種方法。①局部移植：在損傷部位采取單點或多點局部直接注射；②靜脈移植：將MSCs經(jīng)靜脈注射以到達損傷部位。然而，在臨床上采用MSCs移植治療無法確定細胞的劑量保證其有效性[20]，這需要在基礎(chǔ)和臨床研究中進一步探討。另外，細胞移植還可能存在免疫抑制、刺激惡性腫瘤的生長以及細胞的病態(tài)分化等問題[21]。

采取不同的移植方法可能引起不同的移植問題，將MSCs局部移植到損傷部位可能引起局部的病理反應，而靜脈移植可能引起更大的反應，如移植的細胞可能并沒有進入損傷部位而是流到了機體的主要器官[22-23]，包括肺臟、心臟、脾臟、腎臟、肝臟等，這樣就影響了其治療效果。MSCs的低免疫原性使其在治療難治性自身免疫性疾病中開辟了一個新的治療方法，但這種低免疫原性也會引起產(chǎn)品的安全性問題。MSCs的移植可能逃避免疫監(jiān)視，使受體更容易受到機會性感染。如果移植的細胞中含有腫瘤細胞，那么MSCs就可能變?yōu)槟[瘤相關(guān)的表型而通過直接或間接促進腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移或血管生成而支持腫瘤的生長[24]，盡管還不清楚MSCs是否通過免疫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)還是其他的原因而促進了腫瘤細胞的生長。有些患有如糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化病等疾病的患者，不能采用自體干細胞移植，需要異源的干細胞進行治療，但當異源的MSCs移植入體內(nèi)，MSCs有可能被機體認為是外來物質(zhì)，而產(chǎn)生排斥反應，這樣不僅不能起治療效果，而且可能給患者造成嚴重的危害。

將MSCs移植到一個本來不屬于其的地方，是有一定潛在的風險。人們已日益認識到具有“干性”特征的細胞幾乎存在于所有類型的組織，如神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、外周血、脂肪組織、皮膚等。在過去的幾十年中，隨著干細胞領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，發(fā)現(xiàn)這些具有“干性”特征的細胞可以根據(jù)不同微環(huán)境的影響而發(fā)生不同的分化。細胞移植是從原來的微環(huán)境轉(zhuǎn)移到了一個新的環(huán)境。在新環(huán)境中的干細胞可能分化為理想的細胞，但這些有“干性”的細胞也可能形成腫瘤或分化為損傷修復不需要的細胞[25]，甚至細胞的聚集位置也不確定。移植MSCs后，當Wnt信號通路被抑制，MSCs有轉(zhuǎn)化為肉瘤的潛能。這并不奇怪，因為在微環(huán)境作用和病理情況變化下，來源于非損傷組織的MSCs會繼續(xù)其自然發(fā)育趨勢產(chǎn)生非損傷組織的物質(zhì)，從而產(chǎn)生腫瘤，所以，在干細胞移植的應用中，應注意避免這些問題，但遺憾的是，現(xiàn)在許多難治性疾病在傳統(tǒng)治療失效的情況下，不得不采取細胞療法。

綜上所述，在細胞療法的臨床應用中，需要考慮其安全性的問題。對于這些安全性的隱患其根本原因在于醫(yī)療機構(gòu)個體化治療受制于人員技能、場所、時間等，造成誤差累積，也難以滿足大規(guī)模臨床需求；采集、采購、建庫、制備、保存、檢測、評價、傳輸、回輸需要社會專業(yè)化分工完成；工藝路線及注射液處方設(shè)計不合理，未通過極限挑戰(zhàn)考察；干細胞制品開發(fā)需要通過系統(tǒng)化、科學化的研究，質(zhì)量研究應與動物實驗、臨床實驗有機結(jié)合起來，進行全方位、全過程質(zhì)量控制。人類對干細胞的認識尚處幼稚階段，作用靶點和機制不清、體內(nèi)轉(zhuǎn)歸不明、移植后持續(xù)不良反應無法終止、長期植入后果不確定、法規(guī)和技術(shù)標準缺位，因此干細胞濫用必然會帶來災難性的后果，尤其是在發(fā)展中國家，這種現(xiàn)象更為普遍。相關(guān)監(jiān)管部門應建立健全一套細胞療法的標準和準則，消除存在的安全隱患，期盼干細胞移植在經(jīng)歷基礎(chǔ)和臨床實驗后能真正應用于臨床治療，為患者帶來福音。

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（收稿日期：2014-09-26 本文編輯：李亞聰）endprint