趙江民，劉佳，林雁冰，宗根林，吳利忠，錢海珊，游建雄*

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海 201999

2.上海市東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，上海200120

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)是一類具有高度的自我復(fù)制能力和多項(xiàng)分化潛能的細(xì)胞[1-3]。近年來(lái)，隨著分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用適當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記BMSCs，利用MRI成像技術(shù)對(duì)其示蹤，已成為研究的熱點(diǎn)[4-6]。筆者通過(guò)對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行不同濃度超順磁性氧化鐵(SPIO)的體外標(biāo)記，研究其對(duì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響，以及不同標(biāo)記濃度SPIO的MR成像效果，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要儀器和試劑

清潔級(jí)SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司購(gòu)入)，4～6周齡5只。

DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，MR成像儀(3.0 T，Achieva型)(Phillips公司)，F(xiàn)BS(胎牛血清) (美國(guó)Gibco公司)，L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶(1:250) (美國(guó)Hyclone公司)，超順磁性氧化鐵(商品名Resovist；德國(guó)Schering公司)，普魯士藍(lán)染色試劑盒(上海虹橋樂(lè)翔醫(yī)用試劑公司)。

1.2 大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)與傳代

SD大鼠行頸椎脫臼法處死，完整取出股骨、脛骨及肱骨，在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下，用注射器吸取5 ml含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(DMEM/F12，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)反復(fù)沖洗骨髓腔，并用吸管將細(xì)胞懸液吹打混勻。將沖出液直接接種于T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細(xì)胞融合達(dá)80%～90% 即可傳代。用0.25%的胰蛋白酶1 ml消化后按1:2或1:3的比例傳代。以后每隔3～4 d換液，倒置相差顯微鏡逐日觀察，待細(xì)胞融合鋪滿瓶底約80%～90%，重復(fù)上述操作。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原CD34、CD44及CD90

取培養(yǎng)至第4代的細(xì)胞，用PE-CD34、PECD44及FITC-CD90抗體標(biāo)記，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。

1.4 BMSCs的SPIO標(biāo)記及鑒定

SPIO加入到新鮮DMEM/F12(含15%FBS)細(xì)胞培養(yǎng)液中，將SPIO濃度分別調(diào)整為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml，并在這些液體中分別加入0.75 μg/ml的多聚賴氨酸。實(shí)驗(yàn)組：取狀態(tài)良好的第4代BMSCs分別更換上述4種濃度SPIO的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞濃度為1×105/ml，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、濕度95%)孵育48 h，作為實(shí)驗(yàn)組(B、C、D、E)。對(duì)照組(A)：用不含SPIOPLL的DMEM/F12培養(yǎng)液換液，其他條件同實(shí)驗(yàn)組。并在倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。

將經(jīng)SPIO標(biāo)記48 h的實(shí)驗(yàn)組(B、C、D、E)的BMSCs分別進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)各孔3個(gè)低倍鏡視野下的200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比率(陽(yáng)性細(xì)胞比率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.5 SPIO標(biāo)記的BMSCs生物學(xué)特性的檢測(cè)

1.5.1 臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞活性

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組共5組細(xì)胞制為細(xì)胞懸液，取9滴細(xì)胞懸液移入小試管內(nèi)，加入1滴0.4%的臺(tái)盼蘭染液，混勻，在光鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，死細(xì)胞染為藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，每組重復(fù)3次，并計(jì)算活細(xì)胞百分率(活細(xì)胞率=活細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%)。

1.5.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組共5組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度2×104/ml)，按每孔200 μl接種于96孔板中，每組設(shè)10個(gè)平行對(duì)照孔。分別在接種后第5天采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6 SPIO標(biāo)記的BMSCs體外MRI

對(duì)照組、各實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記48 h后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/ml的細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞各取250 μl (細(xì)胞量為5×105)接種于96孔板中，進(jìn)行MR掃描。采用Phillips 3.0 T Achieva型MR成像儀，八通道頭顱線圈(Sense head 8 coil)。視野(FOV) 100 mm×150 mm，層厚0.6 mm，層間距0 mm，矩陣163×163；采用3D-FFE (TR 100 ms，TE 4.6～40 ms，echo 5，F(xiàn)lip 15°)。測(cè)量各孔細(xì)胞懸液圖像的信號(hào)強(qiáng)度，ROI為5 mm×5 mm。相對(duì)信號(hào)值=標(biāo)記BMSCs的信號(hào)強(qiáng)度÷對(duì)照的普通BMSCs的信號(hào)強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示，細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖結(jié)果及MRI信號(hào)強(qiáng)度比較采用方差分析，以P<0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs表面抗原的檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原，表面抗原CD34表達(dá)陰性，CD44 、CD90表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞分別在98%、90%左右，表明分離培養(yǎng)得到的MSCs純度較高(圖1)。

2.2 SPIO標(biāo)記BMSCs

2.2.1 倒置相差顯微鏡下，離心后觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標(biāo)記的BMSCs保持原有的梭形形態(tài)，在胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核周圍可見(jiàn)到聚積的褐色顆粒物。但在75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標(biāo)記后的BMSCs中，雖然部分仍保持原有的梭形形態(tài)，但細(xì)胞間出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片及散在褐色顆粒聚集物，100μg/ml標(biāo)記的細(xì)胞膜模糊、細(xì)胞與細(xì)胞之間的邊界不清(圖2)。四種濃度SPIO標(biāo)記48 h后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心后，可見(jiàn)沉積的細(xì)胞團(tuán)塊呈現(xiàn)為棕褐色，且隨著SPIO的濃度增加其細(xì)胞團(tuán)塊顏色也逐漸加深(圖3)。

2.2.2 標(biāo)記效率檢測(cè)

SPIO濃度為25、50、75及100 μg/ml標(biāo)記48h的BMSCs經(jīng)普魯士藍(lán)染色后顯微鏡下觀察，細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)成簇或散在分布的細(xì)小的藍(lán)色鐵顆粒，并隨著SPIO濃度的增加，藍(lán)色鐵顆粒有所增多。這4個(gè)組標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞率分別為：99%、100%、100%、100%(圖4)。

2.3 SPIO標(biāo)記BMSCs生物學(xué)特性的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)

25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml、100 μg/ml濃度的SPIO標(biāo)記后，經(jīng)臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞比率分別為95.51±1.20、96.03±1.78、92.73±0.98和90.44±2.24，未標(biāo)記BMSCs活細(xì)胞比率為95.35±1.37。與未標(biāo)記組相比， SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml標(biāo)記的BMSCs活細(xì)胞比率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而SPIO濃度為75 μg/ml、100 μg/ml時(shí)，活細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.0026、0.0028(P<0.05)，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞活力有明顯抑制作用。

2.3.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

MTT結(jié)果顯示，濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的實(shí)驗(yàn)組SPIO標(biāo)記對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響；而濃度為75 μg/ml、100 μg/ml的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，明顯抑制細(xì)胞增殖，P值分別為0.01663、0.01659(P<0.05；表1)。

2.4 MRI掃描結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的MRI信號(hào)強(qiáng)度和吸光度(OD)值(±s)Tab.1 MRI signal intensity and absorbance (OD) value of experimental and control groups(±s)

Note: aP<0.05 compared with control group.

Group Signal intensity Absorbance (OD) value (n=10)Control group 1260.2±145.8 0.4886±0.039125 μg/ml 1005.3±262.5 0.4807±0.035250 μg/ml 711.3±198.3a 0.4701±0.033975 μg/ml 556.5±145.6a 0.4523±0.0423a 100 μg/ml 340.4±102.8a 0.4429±0.0309a

在SPIO標(biāo)記48h的BMSCs MRI掃描圖像上，當(dāng)SPIO標(biāo)記濃度為25 μg/ml時(shí)，細(xì)胞懸液的信號(hào)最高，與對(duì)照組BMSCs相比較，信號(hào)強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)SPIO濃度≥50 μg/ml，標(biāo)記細(xì)胞的T2信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照組BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號(hào)強(qiáng)度也逐漸降低，當(dāng)濃度為100 μg/ml時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度為最低信號(hào)(表1，圖5)。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記方法眾多，目前，由于磁對(duì)比劑標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MRI活體示蹤具有非侵襲性、可重復(fù)性、動(dòng)態(tài)性等特點(diǎn)，故利用MRI定位及監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞遷徙情況已成為重要的研究手段[7-8]。其中，超順磁性氧化鐵(SPIO)也已成為應(yīng)用最為廣泛的陰性對(duì)比劑[9]。

3.1 BMSCs 的SPIO標(biāo)記

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面抗原CD34、CD44及CD90的結(jié)果 圖2 A為未標(biāo)記的BMSCs；B～E分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml SPIO標(biāo)記48 h的BMSCs ( ×100) 圖3 SPIO標(biāo)記：不同濃度SPIO標(biāo)記BMSCs 48 h，離心后細(xì)胞的團(tuán)塊 圖450 μg/ml SPIO標(biāo)記BMSCs48h后普魯士藍(lán)染色(A： ×100；B： ×200) 圖5 不同濃度SPIO (μg/ml)標(biāo)記BMSCs的MR圖像Fig.1 Detection of MSCs surface antigen CD34, CD44 andCD90 by fl ow cytometry. Fig.2 A: unlabeled BMSCs.B—E: BMSCs labeled with different concentration in 25 μg/ml, 50 μg/ml, 75 μg/ml and 100 μg/ml after 48 h ( ×100). Fig.3 BMSCs labeled with different concentration of SPIO for 48 h after centrifugation. Fig.4 BMSCs labeled with 50 μg/ml SPIO for 48h after the Prussian blue staining (A: ×100.B: × 200). Fig.5 MR images of BMSC labeled with different concentrations of SPIO (μg/ml).

SPIO的核心結(jié)構(gòu)為氧化鐵顆粒(3～5 nm)，其表面帶有負(fù)電荷，由于細(xì)胞膜也帶負(fù)電荷，因此未經(jīng)表面修飾的SPIO納米顆粒很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[10-11]。多聚賴氨酸(PLL)(常用轉(zhuǎn)染劑之一)，其表面帶有正電荷，通過(guò)靜電作用與表面帶有負(fù)電荷的SPIO顆粒結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞胞吞噬或胞飲，從而提高細(xì)胞標(biāo)記率[12]。本研究采用PLL修飾SPIO，即PLL-SPIO，對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記的成功率非常高，經(jīng)普魯士藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)SPIO濃度分別為25 μg/ml、50 μg/ml、75 μg/ml及100 μg/ml時(shí)體外標(biāo)記BMSCs的細(xì)胞陽(yáng)性率分別為99%、100%、100%、100%。倒置顯微鏡下及細(xì)胞離心后觀察，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核周圍可見(jiàn)到聚積的褐色顆粒物及試管內(nèi)褐色的細(xì)胞團(tuán)塊，且隨著SPIO的濃度增加其細(xì)胞團(tuán)塊顏色也逐漸加深，再次印證了細(xì)胞內(nèi)的鐵顆粒濃度與加入培養(yǎng)液內(nèi)的SPIO濃度呈正相關(guān)，這與Daldrup-Link等[13]的結(jié)果一致。

3.2 SPIO標(biāo)記對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響

雖然SPIO的標(biāo)記濃度越高，細(xì)胞的標(biāo)記率越高，MR成像的效果會(huì)越好，但標(biāo)記濃度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞的生物學(xué)活性及其增殖能力[14]，從而影響到活體成像的追蹤觀察；而適宜濃度SPIO標(biāo)記BMSCs并不影響體外干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化能力[15-16]。因而選擇適宜的標(biāo)記濃度至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SPIO濃度為25 μg/ml、50 μg/ml的SPIO標(biāo)記后的BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠保持細(xì)胞原有的梭形形態(tài)，正常貼壁生長(zhǎng)并傳代，臺(tái)盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)及MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)證實(shí)標(biāo)記后的細(xì)胞仍具有較高的活性及增殖能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Arbab等[17]及Ben-Hur等[18]研究結(jié)果相似。而當(dāng)SPIO濃度為75 μg/ml和100 μg/ml時(shí)，活細(xì)胞率分別為92.70%和90.41%，明顯低于對(duì)照組，且細(xì)胞增殖明顯受到抑制，說(shuō)明當(dāng)SPIO濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性作用。這可能與細(xì)胞內(nèi)非結(jié)合的鐵能使氧化作用加強(qiáng)，形成過(guò)多的氧化產(chǎn)物和羥基自由基，造成細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死有關(guān)[19]。

3.3 體外MRI成像

經(jīng)SPIO標(biāo)記BMSCs的MRI成像觀察，證實(shí)SPIO主要縮短了T2*及T2弛豫時(shí)間，1×103/ml的細(xì)胞濃度就能引起明顯的信號(hào)變化[20]，且經(jīng)表面轉(zhuǎn)染的SPIO標(biāo)記是觀察所標(biāo)記干細(xì)胞的最有效方法[16]。在本研究MRI上，觀察到SPIO標(biāo)記48 h的各組細(xì)胞懸液的信號(hào)強(qiáng)度，與未標(biāo)記對(duì)照組BMSCs相比較，均表現(xiàn)為不同程度的低信號(hào)，但SPIO標(biāo)記濃度為25 μg/ml時(shí)，與普通BMSCs相比較，信號(hào)強(qiáng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)SPIO濃度≥50 μg/ml時(shí)，標(biāo)記細(xì)胞的T2信號(hào)強(qiáng)度與普通BMSCs相比較均有明顯差異(P<0.05)，隨著SPIO濃度的增加信號(hào)強(qiáng)度也逐漸降低，這也說(shuō)明隨著SPIO標(biāo)記濃度的增加，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的SPIO也有所增加，產(chǎn)生了更為明顯的負(fù)性對(duì)比效應(yīng)，這與Lee等[21]報(bào)道一致。

本研究標(biāo)記方法簡(jiǎn)單易行且安全有效，同時(shí)MRI能夠探測(cè)到干細(xì)胞在活體內(nèi)的分布和遷移[15]。但該方法還存在不足之處：由于MRI只能觀察標(biāo)記細(xì)胞的鐵含量變化，故只能對(duì)標(biāo)記細(xì)胞起示蹤依據(jù)，不能對(duì)標(biāo)記細(xì)胞的定量和定性分析，無(wú)法分析細(xì)胞的增殖及分化情況，所以影響以后干細(xì)胞在體內(nèi)移植后的觀察價(jià)值。相信分子影像技術(shù)的運(yùn)用和標(biāo)記方法的改進(jìn)是未來(lái)研究的方向。另外Rosenberg等[22]發(fā)現(xiàn)SPIO標(biāo)記hMSCs在缺血缺氧環(huán)境下其細(xì)胞活性大幅降低，所以該標(biāo)記方法運(yùn)用于腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷挠绊懀写嗟脑囼?yàn)證實(shí)。同時(shí)，王建東等[23]發(fā)現(xiàn)鐵蛋白與SPIO相互作用，并可以延長(zhǎng)MRI活體細(xì)胞示蹤時(shí)間，克服了SPIO無(wú)法長(zhǎng)期標(biāo)記示蹤的缺陷。

總之，本研究通過(guò)全骨髓直接貼壁法能在體外成功培養(yǎng)并擴(kuò)增出大鼠BMSCs，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分化潛能及流式細(xì)胞儀鑒定證實(shí)；采用濃度為25～50 μg/ml的SPIO聯(lián)合0.75 μg/ml PLL體外標(biāo)記大鼠BMSCs安全、可靠，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的表型、活力和增殖等生物學(xué)特性產(chǎn)生明顯的影響；MR掃描在T2WI序列上能有效觀察到濃度為50 μg/ml標(biāo)記SPIO標(biāo)記BMSCs 48 h后的信號(hào)變化。

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