孫菲

(福建省微生物研究所，福建福州，350007)

胰脂肪酶抑制劑Lipstatin由毒三素鏈霉菌(Streptomyces tocytricini)代謝產(chǎn)生，它通過選擇性地抑制胃腸道內(nèi)的胰脂肪酶減少30%的脂肪的分解和吸收，從而達到減重的目的，是目前唯一通過非中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用治療肥胖癥的藥物［1-2］，其作用機制獨特，安全性高。Lipstatin的四氫衍生物Orlistat(奧利司他)已被羅氏公司成功開發(fā)為減肥藥Xenical(賽尼可)。由于近年來減肥藥安全問題頻發(fā)，導致了一系列減肥藥物退出市場［3～6］。繼2010年 Sibutramine下架后，Oristat是目前市場上唯一的OTC減肥藥，占據(jù)了減肥藥市場80%的市場份額［7］。作為Oristat合成的關(guān)鍵中間體，生物合成Lipstatin的發(fā)酵備受關(guān)注。目前國內(nèi)對Lipstatin發(fā)酵的研究多見于搖瓶水平的研究［8～12］，發(fā)酵罐工藝方面的報道較少。

本研究前期對Lipstatin搖瓶發(fā)酵條件進行了一系列的優(yōu)化并取得了較好的結(jié)果［13］，但是搖瓶發(fā)酵條件和工業(yè)化發(fā)酵罐生產(chǎn)之間存在著差異，通常不是簡單的放大。從搖瓶到發(fā)酵罐的過渡，在放大過程中往往出現(xiàn)隨著發(fā)酵規(guī)模的擴大，目標產(chǎn)物的產(chǎn)量不斷下降的放大效應(yīng)［14］。目前國內(nèi)能進行Lipstatin發(fā)酵生產(chǎn)的企業(yè)僅有兩家［15］，這與其在放大過程中出現(xiàn)的技術(shù)難點有關(guān)。本研究在前期搖瓶工作的基礎(chǔ)上，利用10 L全自動發(fā)酵罐進行攪拌工藝、通氣量及補料工藝的優(yōu)化，為Lipstatin的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces tocytricini FIM-1015，由福建省微生物研究所保藏。

1.2 培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)方法

1.2.1 斜面瓊脂培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

可溶性淀粉1%，蛋白胨 0.8%，NaCl 2.0%，Mg-SO40.03%，K2HPO40.02%，瓊脂 1.8%，pH 7.5，28 ℃培養(yǎng)7d。

1.2.2 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

甘油2.5%，黃豆餅粉2.5%，酵母粉0.5%，葵花籽油 1.0%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，瓊脂1.8% ，pH 7.0，裝量50 mL/500 mL，28 ℃培養(yǎng)30 h。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

豆油5%、甘油 1.5%，黃豆粉 2%，玉米漿粉0.85%，卵磷脂1.5%，pH 7.0，裝量 50 mL/500 mL，搖床轉(zhuǎn)速280 r/min，28℃培養(yǎng)8d。

1.3 分批發(fā)酵培養(yǎng)方法

發(fā)酵罐為BGZ-7智能型機械攪拌發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備)，體積10 L，搖瓶種子按1.2.2培養(yǎng)方法制備，接種量2.5%。發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基裝量7L，發(fā)酵溫度28℃，罐壓0.04 MPa，控制攪拌轉(zhuǎn)速及溶氧，實時監(jiān)控各項參數(shù)。

1.4 測定方法

1.4.1 Lipstatin 發(fā)酵效價測定

試樣制備發(fā)酵液與無水乙醇1∶4稀釋搖勻浸泡1 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液用高效液相色譜法(HPLC)測定Lipstatin發(fā)酵效價。

HPLC色譜條件 色譜柱C18ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測器DAD(HP1100)，柱溫40 ℃，檢測波長195 nm，流動相為乙腈∶水(85∶15)，流速1 mL/min。

1.4.2 pH 測定

采用酸度計測定。

1.4.3 菌體干重測定(DCW)

取10 mL發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀經(jīng)2次蒸餾水洗滌后，用干燥定量濾紙過濾，105℃烘干至恒重，稱量菌絲體干重。

1.4.4 菌絲形態(tài)觀察［16］

菌絲經(jīng)石炭酸美藍復合染色劑染色后以顯微鏡油鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶氧對Lipstatin發(fā)酵的影響

搖瓶發(fā)酵過程中的溶氧是由空氣通過瓶口的介質(zhì)擴散來提供氧氣的，通過調(diào)整搖瓶裝液量及搖瓶轉(zhuǎn)速控制搖瓶發(fā)酵中的溶氧水平考察溶氧對Lipstatin發(fā)酵的影響。表1為500 mL搖瓶中不同裝液量對Lipstatin發(fā)酵的影響，實驗結(jié)果表明搖瓶裝液量對Lipstatin發(fā)酵效價的影響較大，當裝液量高于50 mL/500 mL三角瓶時，其發(fā)酵效價顯著下降。表2為不同搖床轉(zhuǎn)速對Lipstatin發(fā)酵效價的影響，實驗結(jié)果顯示，當搖床轉(zhuǎn)速低于280 r/min時，Lipstatin發(fā)酵效價降低，當搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時，其相對效價僅為對照的53.1%。表1和表2的結(jié)果均表明Lipstatin發(fā)酵對溶氧的要求較高。

表1 搖瓶裝液量對Lipstatin發(fā)酵效價的影響Table 1 The effect of medium volume on Lipstatin productivity

表2 搖床轉(zhuǎn)速對Lipstatin發(fā)酵效價的影響Table 2 The effect of rotating speed of shaking bed on Lipstatin procuctivity

2.2 剪切力對Lipstatin發(fā)酵的影響

發(fā)酵罐采用機械攪拌方式增加溶氧水平，攪拌產(chǎn)生的剪切力對菌株發(fā)酵有一定的影響。在搖瓶中添加玻璃珠可以模擬發(fā)酵罐中機械攪拌對微生物發(fā)酵的影響。表3為添加直徑為5mm玻珠對Lipstatin發(fā)酵效價的影響，實驗結(jié)果表明添加玻璃珠個數(shù)對Lispstatin發(fā)酵效價影響較大，當添加4個玻璃珠時，其效價下降約40%，說明Lipstatin產(chǎn)生菌Streptomyces tocytricini FIM-1015對剪切力較為敏感，過強的剪切力易致菌絲體受到機械損傷，抑制菌體生長，不利于Lipstatin的生物合成。

表3 玻璃珠個數(shù)對Lipstatin發(fā)酵效價的影響Lable 3 The effect of glass beads number on Lisptatin productivity

2.3 Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵工藝優(yōu)化

從2.1的結(jié)果可知，Lipstatin的發(fā)酵對溶氧的要求較高，發(fā)酵罐分批發(fā)酵其溶氧水平與攪拌速度、通氣量及發(fā)酵液濃度等因素相關(guān)，因此Lipstatin發(fā)酵罐分批發(fā)酵將對以上工藝進行優(yōu)化。

2.3.1 攪拌工藝對Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的影響

鑒于Lipstatin的發(fā)酵對溶氧的要求較高，同時對剪切力較為敏感，因此制定Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的攪拌工藝策略為發(fā)酵前期低轉(zhuǎn)速攪拌以保證菌絲體的生長，發(fā)酵中后期提高攪拌速度，改善溶氧，促進Lipstatin的生物合成。

2.3.1.1 起始攪拌速度的考察

按1.3的培養(yǎng)方法，設(shè)起始攪拌速度為150、200、250、300 r/min，通氣量為 10 L/min，24 h 取樣觀察菌絲形態(tài)，比較不同起始攪拌速度下的菌體量、溶氧水平及Lipstatin產(chǎn)生效價。實驗結(jié)果表明，當攪拌起始轉(zhuǎn)速為250、300 r/min時，由于攪拌產(chǎn)生的剪切力過大，菌絲體斷裂自溶(圖1-c、圖1-d)，不利于菌絲體生長，發(fā)酵周期內(nèi)菌體量極低(圖2-a)，幾乎無效價產(chǎn)生。起始攪拌速度為150、200 r/min時，菌絲體生長健壯(圖1-a、圖1-b)，但起始攪拌速度為200 r/min時，發(fā)酵罐溶氧水平高于攪拌速度為150 r/min時，相應(yīng)地，其菌體量及發(fā)酵效價也高于攪拌速度為150 r/min(圖2-a、圖2-b)。因此，選擇200 r/min作為Lipstatin發(fā)酵的起始攪拌速度。

2.3.1.2 攪拌終速度的考察

從2.3.1.1 的結(jié)果可知，0 ～24 h 為 Lipstatin 產(chǎn)生菌Streptomyces tocytricini FIM-1015的對數(shù)生長期，菌體生長24 h后菌體量增高(圖2-a)，對剪切力的耐受力增強，此時增加攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生長的不利影響較小。同時0～24 h間耗氧量增大，罐內(nèi)溶氧量急劇下降，使得Lipstatin的發(fā)酵效價遠低于搖瓶水平(圖2-b)。因此，選擇在發(fā)酵24 h后開始逐漸增加攪拌轉(zhuǎn)速。

由圖2-b可見，Lipstatin發(fā)酵效價自96 h開始大幅提高，因此，攪拌工藝選擇自24 h逐漸增加至96 h達到終速度。按1.3的培養(yǎng)方法，設(shè)攪拌終速度為400、450、500、550 r/min，比較不同攪拌終速度對 Lipstatin發(fā)酵過程中的溶氧及發(fā)酵效價的影響。

圖1 不同起始攪拌速度對菌絲形態(tài)的影響Fig.1 The effect of initiative mixing speed on mycelial morphology

圖2 不同起始攪拌速度對Lipstatin發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of intiative mixing speed on Lipstatin productivity

圖3 不同攪拌終速度對Lipstatin發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of ultimate mixing speed on Lipstatin producitivity

圖3結(jié)果表明，攪拌轉(zhuǎn)速對Lipstatin發(fā)酵的溶氧水平和效價有顯著影響。攪拌終轉(zhuǎn)速在400～550 r/min范圍內(nèi)，隨著攪拌終轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵罐溶氧水平及Lipstatin發(fā)酵效價隨之提高，但攪拌終轉(zhuǎn)速為500 r/min時其發(fā)酵效價與550 r/min時相差不大，因此最佳攪拌終轉(zhuǎn)速為500 r/min。通過優(yōu)化攪拌工藝，使Lip-statin發(fā)酵效價達到4 300 μg/mL，與搖瓶發(fā)酵水平相當。發(fā)酵時間為168 h，比搖瓶發(fā)酵時間縮短1d。

2.3.2 通氣量對Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的影響

按1.3培養(yǎng)方法，采取2.3.1攪拌工藝進行Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵，設(shè)通氣量分別為8、10、12、15 L/min，比較不同通氣量下的溶氧及Lipstatin發(fā)酵效價，以確定最佳通氣量。

實驗結(jié)果表明(圖4)，通氣量對溶氧及Lipstatin發(fā)酵效價的影響較小?？赡茉驗長ipstatin發(fā)酵培養(yǎng)基為特殊的高油培養(yǎng)基，高濃度豆油與乳化劑卵磷脂作用使得培養(yǎng)基呈現(xiàn)較高的黏稠度，即使增大通氣量，也不利于氧在培養(yǎng)基介質(zhì)中的擴散。

圖4 不同通氣量對Lipstatin發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of ventilatory capacity on Lipstatin producitivity

2.3.3 補料工藝對Lipstatin 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的影響

攪拌工藝的優(yōu)化能顯著提高24～96h間發(fā)酵罐的溶氧水平，但96 h后溶氧水平急劇下降，實驗中觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液逐漸變黏稠，即使提高轉(zhuǎn)速也不能有效增加溶氧(圖3-a)。這可能是由于Lipstatin發(fā)酵培養(yǎng)基為高油培養(yǎng)基，質(zhì)地黏稠，發(fā)酵過程中菌絲的生長和產(chǎn)物的合成進一步增強發(fā)酵液的粘稠度，同時Lipstatin發(fā)酵過程中通氣量大，攪拌速度快，水分易蒸發(fā)，使發(fā)酵液黏稠度進一步增高等原因?qū)е碌?。采取補料工藝是改善溶氧、提高Lipstatin發(fā)酵水平的有效方法。降低基礎(chǔ)配料中豆油的含量(從5%到3%)，分別在發(fā)酵 72、96、120h 時補加 1.5%豆油，補料量是發(fā)酵液體積的0.5%。

圖5 補料工藝對Lipstatin發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of fed bacth fermentation on Lipstatin productivity

由圖5-a可見，分批發(fā)酵72 h后pH持續(xù)上升，192 h pH達到8.0，這可能是因為發(fā)酵時菌體利用速效氮源產(chǎn)生游離NH4+引起的。分批發(fā)酵96 h后溶氧水平急劇降低，Lipstatin效價增長速度在144 h后趨緩。圖5-b顯示補料發(fā)酵72 h后pH緩慢下降，192 h pH為6.3，這可能是因為補料后油脂分解產(chǎn)生脂肪酸會中和OH-，所以發(fā)酵中后期pH較為穩(wěn)定，補料發(fā)酵96h后溶氧水平保持在30%以上，溶氧水平較分批發(fā)酵顯著提高，補料發(fā)酵恒定的pH環(huán)境和較高的溶氧水平大大促進了Lipstatin的合成，發(fā)酵144 h后Lipstatin效價仍以較快速度增長，168 h發(fā)酵效價達到6 446μg/mL，比分批發(fā)酵產(chǎn)量提高50%。

3 討論

Lipstatin產(chǎn)生菌的生長及Lipstatin的生物合成對溶氧水平有較高的要求，而Lipstatin發(fā)酵培養(yǎng)基為特殊的高油培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中豆油與乳化劑卵磷脂相互作用使培養(yǎng)基呈現(xiàn)較高的黏稠度，發(fā)酵過程中菌絲的生長和水分的蒸發(fā)則進一步增高發(fā)酵液的黏稠度，不利于氧在發(fā)酵液中的擴散，增大通氣量不能有效提高發(fā)酵過程中的溶氧水平。

本研究根據(jù)Lipstatin發(fā)酵特點優(yōu)化攪拌工藝、建立補料工藝以改善Lipstatin發(fā)酵過程中的溶氧水平。由于Lipstatin產(chǎn)生菌對剪切力敏感，研究建立了前期200 r/min低轉(zhuǎn)速攪拌，發(fā)酵中后期提高攪拌速度，最終攪拌速度為500 r/min的工藝。發(fā)酵96 h后由于菌絲生長、水分蒸發(fā)，發(fā)酵液黏稠度高，溶氧水平急劇下降，此時提高攪拌速度不能有效改善溶氧。通過建立補料工藝，降低基礎(chǔ)配料中豆油比例，于發(fā)酵中后期不同時間補入1.5%的豆油，既降低發(fā)酵培養(yǎng)基的黏稠度，發(fā)酵前期溶氧顯著提高，又避免發(fā)酵中后期菌絲大量生長、耗氧過多而供養(yǎng)不足，使發(fā)酵溶氧水平保持在30%以上?？股氐却渭壌x產(chǎn)物的發(fā)酵分為菌體生長期和產(chǎn)物合成期2個階段，一般在菌體生長的對數(shù)末期添加前體物質(zhì)有利于次級代謝物的合成，補料工藝的建立也在Lipstatin合成階段為其提供前體物質(zhì)(豆油)。通過以上工藝的優(yōu)化，Lipstatin 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵效價達到6 446μg/mL，較搖瓶發(fā)酵效價提高約40%，發(fā)酵周期縮短1d。本研究結(jié)果為Lipstatin的工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

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