非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)在食醋鑒別中的應(yīng)用研究

楊代明 方宣啟

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

食醋的質(zhì)量因原料的種類、配比、釀造工藝等不同而異。釀造食醋是單獨或混合使用各種含有淀粉、糖類、酒精的原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀制而成的液體酸性調(diào)味液［1］，其色、香、味是由碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪及其它成分經(jīng)曲霉菌、酵母菌和細(xì)菌發(fā)酵而生成的，組成極為復(fù)雜。以山西老陳醋為例，以高粱為主料，先加入多量酒曲，采用低溫厭氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精，再拌入谷糠、麩皮進(jìn)行好氧發(fā)酵產(chǎn)生醋酸。將一半醋醅進(jìn)行熏醅，另一半醋醅進(jìn)行淋醋，以所得醋液再浸泡熏醅，淋得新醋。新醋再經(jīng)夏日伏曬、冬季撈冰的長期陳釀和濃縮工序制成。內(nèi)含多種有機酸（其中50%～60%醋酸及多種不揮發(fā)酸）、18種氨基酸、醇、酯、酚、醛、還原糖、多糖、黃酮、多酚等多種有機物及無機物（鐵、鈉、鈣鎂等）。配制食醋是以釀造食醋為主體即≥50%，與食用醋精、食品添加劑等混合物配制而成的調(diào)味食醋［2］。由于乙酸部分來源于釀造食醋，部分來源于冰乙酸，通過檢測乙酸無法判斷其來源的比例，采用化學(xué)分析及感官鑒定來判定食醋質(zhì)量的優(yōu)劣，并不能全面說明食醋的真正質(zhì)量。

可見無論是生產(chǎn)原料、生產(chǎn)工藝，還是成品質(zhì)量、滋味，釀造食醋和配制食醋都存在著比較大的區(qū)別。但釀造食醋和配制食醋的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)基本一致，而液態(tài)發(fā)酵食醋和配制食醋的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除總酸要求不一樣外，均不要求不揮發(fā)酸，可溶性無鹽固形物都要求大于0.5g/100mL，其他要求基本相同。由酒精為原料的液態(tài)發(fā)酵食醋及其配制醋只要求總酸，不要求可溶性固形物和不揮發(fā)酸。對以食用醋精配制的假配制食醋，其有機酸主要由90%～100%的醋酸組成，不揮發(fā)酸、氨基酸等物質(zhì)很少或基本沒有。這就使得釀造食醋和配制食醋及食用醋精勾兌的醋酸溶液（稱之為化學(xué)食醋）可區(qū)分的界限不明顯，難以從本質(zhì)上鑒別釀造食醋和配制食醋，致使以“化學(xué)食醋”充當(dāng)配制食醋或釀造食醋、以配制食醋充當(dāng)釀造食醋的現(xiàn)象相當(dāng)嚴(yán)重，由于鑒別真?zhèn)蔚臉?biāo)準(zhǔn)缺失，無法進(jìn)行規(guī)范。

色譜指紋圖譜［3－5］是國際公認(rèn)的中藥及天然藥物的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量控制的最有效的手段。非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)的原料與色譜指紋圖譜技術(shù)是截然相反的，能參與振蕩反應(yīng)的所有物質(zhì)整體表現(xiàn)在E—t曲線上是否振蕩、振蕩時間、振蕩周期、振蕩周期數(shù)及振蕩峰谷連線、振蕩峰連線的曲線形狀中，已經(jīng)成功應(yīng)用于中藥鑒別［6－9］。前期筆者已經(jīng)對非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)在食醋鑒別中的原理進(jìn)行了研究［10］。本研究擬采用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)對釀造食醋和配制食醋進(jìn)行鑒別，旨在研究出能整體表征釀造食醋含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

非線性化學(xué)指紋圖譜測定儀：MZ-1A型，配217型復(fù)合甘汞電極，中南大學(xué)與湖南尚泰測控科技有限公司聯(lián)合研制；

金屬鉑電極：213型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

自動電位滴定儀：ZDJ-400D型，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 材料與試劑

硫酸、丙酮、硝酸銀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

溴酸鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

硫酸錳：分析純，臺山市粵僑試劑塑料有限公司；

食用醋精：濮陽市天口實業(yè)有限公司；

食醋樣本（見表1）：加加集團(tuán)（長沙）有限公司。

表1 食醋樣本編號、名稱及來源Table 1 Numbers，names and source of vinegar samples

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品供試液的制備 取2.0mL食醋樣品于燒杯中，用自動電位滴定法測出食醋中NaCl的含量。準(zhǔn)確量取1 00mL食醋樣本，加入適量硝酸銀，并充分?jǐn)嚢柚燎『猛耆恋砣芤褐新入x子，離心，取上清液備用。

1.3.2 非線性化學(xué)指紋圖譜的分析方法 準(zhǔn)確加入適量的去鹽后的食醋樣品、25mL H2SO4溶液、8mL丙酮溶液和15mL硫酸錳溶液于反應(yīng)器中，蓋好帶溫度計、注射孔和電極的反應(yīng)器蓋。開啟超級恒溫儀調(diào)節(jié)反應(yīng)器內(nèi)溫度為37.0℃，恒溫、恒速攪拌10.0min時，通過注射器迅速加入5.0mL溴酸鈉溶液，即刻點擊菜單采集數(shù)據(jù)，記錄非線性化學(xué)指紋圖譜至電位振蕩消失并出現(xiàn)電位平衡曲線為止。

1.3.3 不同釀造食醋含量的配制食醋非線性化學(xué)指紋圖譜試驗 以編號BY-1的加加陳醋為母液，配制含加加陳醋12.5%，25.0%，37.5%，50.0%，62.5%，75.0%，8 7.5%，100.0%的食醋樣品，添加適量食用醋精、苯甲酸、炒米色等使總酸及外觀與母液一致。分別取8mL上述樣品溶液按1.3.2分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 食用醋精及不同釀造食醋含量樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜分析

B－Z體系，是指由溴酸鹽、有機物在酸性介質(zhì)中，在有（或無）金屬離子催化劑下構(gòu)成的體系。經(jīng)典B－Z振蕩反應(yīng)認(rèn)為，有機底物和催化劑是關(guān)鍵。凡 Mn＋1＋e→Mn＋電極電位在1.51～1.00V的金屬離子均可作為溴酸鹽體系的催化劑，如Ce3＋/Ce4＋（1.44eV），Mn2＋/Mn3＋（1.94eV），即使某些金屬離子不能達(dá)到此條件，但其絡(luò)合物的電極電位卻可滿足 要 求，Ru （bpy）23＋/Ru （bpy）33＋（約 1.3eV），F(xiàn)e（C12H8N2）23＋/Fe（C12H8N2）33＋（1.06eV）。對 于 有 機 底物，要求其電極電位在1.0V以下，一些具有活潑亞甲基的含氧有機化合物恰好符合此條件，如丙二酸、溴化丙二酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、乙酰丙酮、乙酰乙酯等，脂肪族多元羧酸和多元酮及酯都可以作為B－Z反應(yīng)的有機底物，苯酚、苯胺及其衍生物無需催化劑就可以產(chǎn)生振蕩反應(yīng)，草酸、酒石酸、糖類、氨基酸等難以發(fā)生溴代反應(yīng)的有機物，可通過加入溴代劑（如丙酮）構(gòu)成復(fù)合底物產(chǎn)生振蕩反應(yīng)。釀造食醋的主要成分是醋酸，還含有豐富的鈣、氨基酸、琥珀酸、葡萄酸、蘋果酸、乳酸、B族維生素及鹽類等對身體有益的營養(yǎng)成分。氨基酸、琥珀酸、蘋果酸、乳酸等能作為振蕩有機底物促使化學(xué)振蕩的產(chǎn)生及維持。在“H＋＋Mn2＋＋BrO－3＋丙酮”中加入一定體積的食醋樣本，有機底物達(dá)到一定臨界濃度時可誘發(fā)振蕩反應(yīng)，出現(xiàn)振蕩現(xiàn)象。

本試驗取8mL用食用醋精、BY-1、BY-3及按1.3.3制成的配制食醋樣品按1.3.2試驗方法加入到“H＋＋Mn2＋＋BrO－3＋丙酮”中，獲得的非線性化學(xué)指紋圖譜E—t曲線（見圖1（為BY-1樣品的））。食用醋精因不含有機酸、酯、糖等能作為振蕩體系耗散物的物質(zhì)而不發(fā)生振蕩反應(yīng)（見圖1（l）），而釀造食醋含量≥37.5%的配制食醋方能發(fā)生振蕩反應(yīng)（見圖1（c）～（h））。因為釀造食醋（以酒精為原料的發(fā)酵食醋除外）和以釀造食醋為主體的配制食醋，均含有有機酸、醇、酯、酚、醛、糖等多種有機物，有些還含有川芎素、黃酮、多酚功能性成分。當(dāng)BY-1樣品的釀造食醋含量低于37.5%（但BY-3樣品則為30%）時，體系中因耗散物的濃度不足，不能達(dá)到振蕩反應(yīng)條件而不發(fā)生化學(xué)振蕩，其E—t曲線為一條平直的直線。這表明，若加入食醋樣品20min內(nèi)不發(fā)生化學(xué)振蕩反應(yīng)，表明其釀造食醋的含量低于37.5%或30%。隨著BY-1或BY-3樣品的釀造食醋濃度的增大，其非線性化學(xué)指紋圖譜出現(xiàn)規(guī)律性的變化，振蕩壽命越來越長，振蕩周期數(shù)越來越多（見表2）。

由圖1（c）～（h）可知，在一定濃度范圍內(nèi)，增加相同量的振蕩底物，振蕩周期數(shù)增加越多，振蕩周期數(shù)（y）與釀造食醋含量（x）呈二次函數(shù)關(guān)系：對于BY-1樣品而言：y＝0.007 7x2－0.592 9x＋12.823（37.5≤x≤100）；對于BY-2樣品而言：y＝0.008 8x2－0.667 4x＋14.052（30≤x≤100），y值取小數(shù)點后一位，相關(guān)系數(shù)r分別達(dá)到0.996和0.997。其中，BY-1樣品的釀造食醋含量達(dá)到37.5%時，體系發(fā)生振蕩反應(yīng)，出現(xiàn)第1個周期性振蕩；BY-3樣品的釀造食醋含量在30%時產(chǎn)生首次振蕩現(xiàn)象。這表明含30%BY－3（為香醋）的樣品比含37.5%BY-1（為陳醋）的樣品中有機振蕩底物的含量略高些，實際上BY-3樣品及BY-1樣品的可溶性無鹽固形物含量分別為7.1%和7.5%，表明發(fā)生振蕩反應(yīng)所需最低底物濃度（閥值）是一致的。低于50%BY－1含量的配制食醋振蕩周期數(shù)小于3個振蕩周期，或振蕩壽命小于7.5min時，可以判斷該產(chǎn)品為BY-1釀造食醋含量不合格的勾兌食醋。BY-1釀造食醋含量高于50%，不到100%的配制食醋，其振蕩周期數(shù)或振蕩壽命明顯少于100%的釀造食醋。

因此，非線性化學(xué)指紋圖譜較易判斷食醋樣品是否為配制食醋或釀造食醋，食醋振蕩周期數(shù)與釀造食醋含量的關(guān)系至少可以作為企業(yè)對自身產(chǎn)品進(jìn)行在線質(zhì)量控制的有效檢驗方法，或可以作為企業(yè)識別市場上假冒偽劣自身產(chǎn)品的有效檢驗方法。

圖1 食用醋精及不同釀造食醋含量的樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜E—t曲線Figure 1 Nonlinear chemical fingerprint E—t curve of samples of different amount of fermented vinegar and edible vinegar

表2 樣品中BY-1釀造食醋含量與振蕩壽命、振蕩周期數(shù)的關(guān)系Table 2 The relationship of BY-1fermented vinegar amount of sample and oscillation life，oscillation periodic number

2.2 食醋的可溶性無鹽固形物與非線性化學(xué)指紋圖譜振蕩周期的關(guān)系

以BY-2、BY-3為母液，配制不同含量可溶性無鹽固形物的食醋溶液，并于丙酮體系中試驗，獲得的非線性化學(xué)指紋圖譜振蕩周期對可溶性無鹽固形物作圖，見圖2。由圖2可知，隨著可溶性無鹽固形物含量的增大，非線性化學(xué)指紋圖譜的振蕩周期減小，可溶性無鹽固形物含量（y）與振蕩周期（x）的關(guān)系為：對 BY-2的釀造食醋而言，y＝0.109 5x2－1.915 4x＋17.255；對BY-3的釀造食醋而言，y＝0.228 5x2－3.047 9x＋19.014 4，可見，至少對同一個企業(yè)生產(chǎn)的釀造食醋產(chǎn)品而言，其變化趨勢是一致的?？扇苄詿o鹽固形物是食醋內(nèi)容物含量指標(biāo)，其含量的高低，直接反映釀造食醋的品質(zhì)好壞。因此，振蕩周期也可用于表征食醋的質(zhì)量。振蕩周期越小，則食醋質(zhì)量越好。

圖2 食醋振蕩周期與可溶性無鹽固形物的關(guān)系Figure 2 The relationship of vinegar oscillation period and soluble saltless solid

3 結(jié)論

勾兌食醋因不含振蕩底物，不發(fā)生化學(xué)振蕩，而釀造食醋與配制食醋均能發(fā)生非線性化學(xué)振蕩反應(yīng)，且配制食醋的振蕩壽命、振蕩周期數(shù)明顯小于釀造食醋。利用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)能很好地將勾兌食醋、配制食醋和釀造食醋鑒別開來，振蕩周期與可溶性無鹽固形物的含量呈規(guī)律性的變化，振蕩周期數(shù)也隨著釀造食醋含量增加而愈發(fā)明顯地增多。用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)鑒別和評價食醋，為釀造食醋、配制食醋的鑒別和質(zhì)量評價提供了一種經(jīng)濟(jì)、易行、簡便和有效的方法。

1 國家國內(nèi)貿(mào)易局.GB 18187—2000 釀造食醋［S］.北京：國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2000.

2 由全國調(diào)味品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會.SB 10337—2000 配制食醋［S］.北京：中華人民共和國商務(wù)部，2000.

3 王夏炎.現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用［J］.中草藥，2004，35（7）：6～9.

4 Jin Y，Liang T，F(xiàn)u Q，et al.Fingerprint analysis of Ligusticum chuanxiong using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase liquid chromatography［J］.J.Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 136～2 141.

5 Ruan G H，Li G K.The study on the chromatographic fingerprint of Fructus xanthii by microwave assisted extraction coupled with GC—MS［J］.J.Chromatogr B，2007，850（1～2）：241～248.

6 Zhang T M，Liang Y Z，Yuan B，et al.Principle，traits and functions of electrochemical fingerprint for distinguishing and evaluating Chinese traditional medicine［J］.Chin Sci.Bull，2007，52（20）：2 753～2 765.

7 Zhang T M，Liang Y Z，Yuan B，et al.Determining method and conditional factors of electrochemical fingerprint of Chinese traditional medicine［J］.Chin Sci.Bull，2007，52（16）：2 190～2 202.

8 張?zhí)┿?，梁逸曾，袁斌，?中藥電化學(xué)指紋圖譜的原理、特點和用途［J］.科學(xué)通報，2007，52（13）：1 513～1 522.

9 張?zhí)┿?，梁逸曾，袁斌，?中藥電化學(xué)指紋圖譜的檢測方法和條件因素［J］.科學(xué)通報，2007，52（9）：1 012～1 120.

10 楊代明，方宣啟，馮敏，等.食醋非線性化學(xué)指紋圖譜摻偽鑒別原理的研究［J］.食品與機械，2012，28（1）：86～92.