復(fù)合微生物發(fā)酵棉稈制備植物栽培基質(zhì)的培養(yǎng)基優(yōu)化

周安盛+楊苗+王常高+杜馨+林建國+蔡俊

摘要：利用固氮菌、酵母菌和高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，采用混菌固態(tài)發(fā)酵的方式，以制備的植物栽培基質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量為衡量指標(biāo)，對棉稈發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在最優(yōu)培養(yǎng)基為棉稈4.7 g，椰樹果殼粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氫二鉀0.304 g，水35 mL時(shí)，制備的植物栽培基質(zhì)蛋白質(zhì)含量達(dá)到29.08%，與發(fā)酵前（19.80%）相比提高了9.28個(gè)百分點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：棉稈;復(fù)合微生物;蛋白質(zhì);發(fā)酵;優(yōu)化

中文分類號：Q939.96 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）21-5241-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.050

Optimizing Medium of Preparing Plant Cultivation Matrix with Compound Microbial Fermentation of Cotton Stalk

ZHOU An-sheng， YANG Miao， WANG Chang-gao， DU Xin， LIN Jian-guo， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Using azotobacter， yeasts and bacteria with high-yield cellulose， mixed solid-state fermentation， response surface methodology， the fermentation medium of preparing plant cultivation matrix was optimized. The results showed that the optimal fermentation medium was 4.7 g cotton stalk， coconut shell powder 0.3 g， peptone 0.8 g， yeast powder 0.1 g， urea 1.72 g， potassium hydrogen phosphate 0.304 g， and water 35 mL. Under the optimal medium， content of protein reached 29.08%， increasing by 9.28 compared with the content of protein （19.80%） before the fermentation.

Key words： cotton stalk; Compound microbial; protein; fermentation; optimization

我國是產(chǎn)棉大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)2007年全國棉花種植面積達(dá)592萬km2，棉花總產(chǎn)量達(dá)762.4萬t[1]，棉花秸稈總產(chǎn)量約為3 000萬t。棉花是新疆的支柱性產(chǎn)業(yè)之一，新疆棉花種植面積約占全國的1/3，棉稈資源相當(dāng)豐富。目前，該地區(qū)棉稈除少量用于造紙、制板、建筑和飼料生產(chǎn)[2-4]等外，剩下的大部分直接還田、焚燒或者就地掩埋。造成以上現(xiàn)狀主要是因?yàn)槊薅捄S富的韌皮纖維和大量的木質(zhì)纖維素，木制化程度高，牲畜適口性差，消化率低，用一般技術(shù)處理難以達(dá)到飼用標(biāo)準(zhǔn)，較少用于飼料，因而多被廢棄。尤其是在農(nóng)村，廣大種植戶無法將棉稈作為有機(jī)肥直接還田，就將棉稈進(jìn)行焚燒，產(chǎn)生大量的CO2等氣體，給生態(tài)環(huán)境帶來污染，造成資源的浪費(fèi)。由于產(chǎn)棉區(qū)氣候干燥，棉花秸稈密實(shí)，難以腐蝕，就地掩埋的棉稈不能及時(shí)變?yōu)榉柿?，會增加土壤的?fù)擔(dān)，使肥力下降[5]。

棉稈的處理在生產(chǎn)實(shí)踐上具有重要意義，方法大致分為以下幾類：生物發(fā)酵[6-8]、化學(xué)法、物理化學(xué)法。常見的用途有作為反芻動(dòng)物的飼料[9，10]，制作養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)酵床，發(fā)酵棉稈還在農(nóng)業(yè)和沼氣生產(chǎn)等方面有一定應(yīng)用[11]。近年來，有機(jī)生態(tài)型無土栽培已成為中國無土栽培發(fā)展的主要形式。有機(jī)基質(zhì)因其理化性質(zhì)穩(wěn)定，供肥充足，來源廣泛，成本低廉，被廣大農(nóng)民接受，因此對基質(zhì)的需求量連年增加[12]。目前關(guān)于油菜、玉米、小麥等秸稈的研究報(bào)道較多[13，14]。前人對棉稈的基質(zhì)配比進(jìn)行了較多研究，如崔元玗等[15]研究了棉稈栽培番茄的最佳基質(zhì)配方，王芳等[16]對雙孢蘑菇的棉稈栽培配方進(jìn)行了研究，但是對發(fā)酵棉稈制備無土栽培基質(zhì)的培養(yǎng)工藝的研究鮮有報(bào)道。

本研究利用固氮菌、酵母菌和高產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，采用混菌固態(tài)發(fā)酵的方式，以制備的植物基質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量為衡量指標(biāo)，對棉稈發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為以棉稈作原料發(fā)酵制備植物栽培基質(zhì)的工藝提供指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

固氮菌、啤酒酵母、熱帶假絲酵母、弗氏埃希氏菌，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

棉稈、椰樹果殼：由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。棉稈經(jīng)白腐菌預(yù)處理一個(gè)月，滅菌，烘干，粉碎至20～60目。椰樹果殼經(jīng)清洗，烘干，粉碎至20～60目。麩皮、大豆粉、玉米粉、大米粉均為市售。

1.2 ?培養(yǎng)基

1）斜面和種子培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基加瓊脂2%）。固氮菌：甘露醇1%、磷酸二氫鉀0.02%、硫酸鎂0.02%、氯化鈉0.02%、硫酸鈣0.01%、碳酸鈣 0.5%。酵母：葡萄糖2%、酵母膏1%、蛋白胨2%。細(xì)菌：蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、氯化鈉0.5%。

2）初始混菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：棉稈5 g、蛋白胨1 g、酵母粉0.3 g、氯化銨2 g、硫酸銨2 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.2 g、水35 mL。

1.3 ?方法

1.3.1 ?蛋白質(zhì)含量的測定 ?采用恒重法[16]去除待測試樣的水分，冷卻，研磨備用。準(zhǔn)確稱取均勻試樣0.5 g，置于100 mL燒杯中，加25 mL水，煮沸加入100 g/L硫酸銅溶液10 mL，25 g/L氫氧化鈉溶液10 mL，間歇性攪拌，放置1 h。定性濾紙抽濾，用60～80 ℃的熱水洗滌沉淀3次，用10 g/L氯化鋇溶液5滴和2 mol/L鹽酸溶液1滴，檢驗(yàn)濾液至不生成白色沉淀為止。將濾紙和沉淀一起在65 ℃條件下烘干至恒重。采用半微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[16]。1.3.2 ?種子液的制備和固態(tài)發(fā)酵條件 ?將上述50 mL種子培養(yǎng)基分裝于250 mL的三角瓶中，121 ℃，20 min滅菌，分別接入已活化的菌株，固氮菌于32 ℃，180 r/min，培養(yǎng)20 h;酵母于30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)20 h;細(xì)菌于37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)10 h，即可制得處于對數(shù)生長期中期的種子液。在發(fā)酵開始時(shí)，先接入固氮菌1.2 mL，24 h后接入兩株酵母菌和細(xì)菌各0.6 mL，總計(jì)接種量3 mL。34 ℃靜置培養(yǎng)96 h。

1.3.3 ?發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 ?采用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對主輔料添加量、硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂5個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析。每個(gè)因素根據(jù)初始發(fā)酵培養(yǎng)基的組分水平，分別選取高水平（+）和低水平（-）進(jìn)行試驗(yàn)。PB試驗(yàn)的因素和水平見表1。PB試驗(yàn)相關(guān)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析以及模型的建立均使用MinitabTM軟件完成。最陡爬坡試驗(yàn)是根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，按照顯著性因素的變化效應(yīng)，進(jìn)一步確定因素水平，為后續(xù)響應(yīng)面選擇合適的中心試驗(yàn)點(diǎn)。最陡爬坡試驗(yàn)的原點(diǎn)和變化步長見表2。

響應(yīng)面（RSM）分析方法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過試驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來確定最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。按照中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD），選取PB試驗(yàn)得到的顯著性因素進(jìn)行研究，以蛋白質(zhì)含量為衡量指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面分析和預(yù)測，獲得發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組成。中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析以及模型的建立和預(yù)測均使用Design-Expert v8.0.6.1軟件完成。CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素和水平見表3。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ?Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)結(jié)果

表4是Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)對試驗(yàn)結(jié)果的方差分析和5個(gè)因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖（圖1）可以看出，硫酸銨、尿素和磷酸氫二鉀均對發(fā)酵棉稈中蛋白質(zhì)含量有顯著性影響，P值分別為0.025、0和0.031，而主輔料和硫酸鎂則為非顯著性因素。因此，對硫酸銨、尿素和磷酸氫二鉀進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，對主輔料、硫酸鎂、蛋白胨和酵母粉進(jìn)行最低添加量試驗(yàn)。

2.2 ?最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)序和結(jié)果見表5。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，棉稈中蛋白質(zhì)含量緩慢上升，在第五組試驗(yàn)時(shí)達(dá)到峰值，為26.957%。因此，尿素和磷酸氫二鉀分別選取2 g和0.2 g作為CCD試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 ?非顯著因素最低添加量試驗(yàn)結(jié)果

棉稈蛋白質(zhì)含量與非顯著因素添加量的關(guān)系見圖2。由圖2可知，通過單因素試驗(yàn)，確定了主輔料添加量為4.7 g和0.3 g，其中輔料果殼粉的添加量為0.3 g，同時(shí)硫酸鎂、蛋白胨和酵母粉的添加量為0、0.8、0.1 g。

2.4 ?中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)面分析

尿素和磷酸氫二鉀兩個(gè)顯著性因素進(jìn)行中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)的運(yùn)行序和結(jié)果見表6。對結(jié)果進(jìn)行方差分析并進(jìn)行二次二元回歸擬合，得到方程為Y=28.773-0.331X1+0.676X2+0.013X1X2-0.576X12-0.324X22，該方程中Y為蛋白質(zhì)含量（%）的預(yù)測值，X1和X2分別為尿素和磷酸氫二鉀的編碼值。此模型的F值為28.06，說明此模型是顯著的。其中X1（P=0.009 5）、X2（P=0.000 2）、X12（P=0.000 7）和X22（P=0.014 3）呈顯著性影響，同時(shí)X1 X2的P值為0.923 2，大于0.05，為不顯著項(xiàng)。此方程的R2達(dá)到了0.937 1，說明此方程具有較好的擬合度。此方程的3D響應(yīng)面圖和等高線圖見圖3。采用脊嶺分析（圖4），預(yù)測通過發(fā)酵棉稈得到最高的蛋白質(zhì)含量為29.168 7%，此時(shí)編碼值X1、X2分別取-0.28和1.04，對應(yīng)的尿素取1.72 g和0.304 g。

對上述發(fā)酵棉稈最優(yōu)化培養(yǎng)基組分進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果蛋白質(zhì)含量的平均值為29.08%，與模型預(yù)測值基本一致，說明該模型的建立是合理的。

3 ?結(jié)論

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，混菌固態(tài)發(fā)酵棉稈制備植物栽培基質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基的組分：棉稈4.7 g，椰樹果殼粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氫二鉀0.304 g，水35 mL。在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，蛋白質(zhì)含量達(dá)到29.08%，與發(fā)酵前（19.80%）相比提高了9.28個(gè)百分點(diǎn)。

有關(guān)發(fā)酵農(nóng)作物秸稈提高其基質(zhì)粗蛋白質(zhì)含量的研究已有較多報(bào)道，但大多是涉及霉菌和酵母菌或者白腐菌和酵母菌的混菌發(fā)酵過程。李海紅等[18]將從牛胃中篩選出的菌株和假絲酵母共同發(fā)酵玉米秸稈，粗蛋白含量提高了13%左右。楊柳燕等[19]對水生植物發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了研究，最高粗蛋白含量達(dá)到了39.88%。潘鋒等[20]用2株真菌、3株酵母與白地霉共培養(yǎng)發(fā)酵稻草，最終粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到了19.37%。以上研究是關(guān)于粗蛋白飼料方面的應(yīng)用，而本試驗(yàn)研究了固氮菌、酵母菌和產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌混菌固態(tài)發(fā)酵棉花秸稈制備植物栽培基質(zhì)的培養(yǎng)基組分，以蛋白質(zhì)含量為衡量指標(biāo)，其中，利用產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌替代傳統(tǒng)的霉菌和白腐菌，能夠簡化工藝，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高效率，同時(shí)加入的固氮菌能夠增加基質(zhì)中氮的含量。本研究成果作為植物栽培基質(zhì)的主料，在實(shí)際應(yīng)用之前，還需要進(jìn)行壓縮比、吸水率等相關(guān)性質(zhì)的研究，同時(shí)，添加其他植物栽培所需營養(yǎng)物質(zhì)和生物膠的復(fù)配試驗(yàn)和放大試驗(yàn)等也需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）

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（責(zé)任編輯 ?趙 ?娟）