楊昌華，朱慧芳

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410013)

地紅霉素(dirithromycin)是第二代紅霉素類大環(huán)(十四元環(huán))內(nèi)酯類抗生素，由紅霉環(huán)胺與脂肪醛酸綜合而成。體內(nèi)非酶水解為紅霉環(huán)胺，通過與敏感病原微生物的50S 核糖體亞基結(jié)合阻礙細菌轉(zhuǎn)肽過程，抑制蛋白質(zhì)的合成而抗菌。體外試驗證明地紅霉素對臨床上多種常見致病菌有抗菌作用。地紅霉素具有與紅霉素相似的抗菌譜，其特點是藥動學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，半衰期長達20 ～50h，不良反應(yīng)相對較?。?，2］。

美國Lilly 公司的產(chǎn)品于1993年9月在西班牙上市，1996年通過FDA 批準在美國上市并收入美國藥典USP 23。目前國內(nèi)有多家研制的地紅霉素腸溶片和腸溶膠囊獲準生產(chǎn)并用于臨床。本文應(yīng)用硫酸顯色法測定自制地紅霉素腸溶片的釋放度，并通過計算相似因子判斷其與原仿藥品的相似程度。

1 實驗儀器與試劑

1.1 儀器

UV-2501PC 紫外掃描儀(島津)，Rcz-6B2 型釋放度儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)，F(xiàn)W-5 型壓片機(天津市拓普儀器有限公司)，MS/S-MS/L 系列電子分析天平(梅特勒)，KQ-500E 型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，CCT-3320 型超純水制備儀(重慶力德)，PHs-2c pH 酸度計(上海儀電)，0.45um 微孔濾膜(上海興亞凈化器材廠)。

1.2 試藥與試劑

地紅霉素(白色粉末湖南九典制藥有限公司)，地紅霉素腸溶片［嘉實(湖南)醫(yī)藥科技有限公司，0.25g，121117］，地紅霉素腸溶片(參比制劑，湖南九典制藥有限公司，0.25g，110302)，氫氧化鈉(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20111008)，磷酸氫二鉀(分析純國藥集團化學(xué)試劑有限公司，20100124)，無水磷酸二氫鉀(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20120524)，鹽酸(分析純，株洲市星空化玻有限公司，20110916)，硫酸(分析純，株洲市星空化玻有限公司，2012062504)，超純水(自制)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 方法建立

參照文獻［3-7］，以900mL pH6.8 磷酸緩沖液溶液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min 的大杯轉(zhuǎn)籃法，硫酸顯色后482nm 測定釋放度。

2.1.1 溶液配置

2. 1. 1. 1 對照溶液配置 取地紅霉素適量(11mg)，精密稱定置100mL 容量瓶中，加pH6.8 磷酸緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻。過濾，取續(xù)濾液5mL 置10mL 容量瓶中，加pH6.8 磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻。取5mL 置10mL 具塞試管，加硫酸(75→100mL)5mL，搖勻，靜置至室溫得對照溶液［11］。

2.1.1.2 供試溶液配置 取地紅霉素腸溶片6 片，溶出儀溶液杯中加入溶出介質(zhì)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為37℃，分別于3、7、10、13、16、20min 取樣10mL(并補液10mL)，微孔濾膜(0.45μm)過濾，取續(xù)濾液5mL 置25mL 容量瓶中，加pH6.8 磷酸緩沖液稀釋至刻度，搖勻。取5mL 置10mL 具塞試管，加硫酸(75→100mL)5mL，搖勻，靜置至室溫即為供試溶液［11］。

2.1.2 檢測波長的確定［7］

在190 ～1100nm 掃描對照溶液，482nm 波長處有最大吸收，選為釋放度的測定波長。

2.1.3 溶出介質(zhì)的選擇［8-9］

根據(jù)地紅霉素的溶解性、地紅霉素腸溶片試行標準及國內(nèi)常用的溶出介質(zhì)，在pH6.0 磷酸鹽緩沖液、pH6.8 磷酸鹽緩沖液、純化水中選擇。

地紅霉素腸溶片在純化水中45min 時不裂片，與對照藥品的情形一致，故排除純化水。采用籃法［10］，轉(zhuǎn)速100 r/min，45 min 取樣，精密量取續(xù)濾液5mL，置25mL 量瓶，加溶出介質(zhì)至刻度，搖勻，482nm 波長處測定吸收值。結(jié)果表明45min 時本品在pH6.8 磷酸緩沖液中的釋放度最高，其pH 值更接近腸道酸堿度，故確定pH6.8 磷酸緩沖液為溶出介質(zhì)。

2.1.4 硫酸濃度的確定［7］

取硫酸及硫酸溶液(50 →100mL)、(75 →100mL)分別測定，每個樣本測3 次，分別用A1、A2、A3 表示，然后取平均值。結(jié)果表明(75→100mL)硫酸溶液最佳。

2.1.5 超聲時間的選擇

精密稱取11mg 地紅霉素對照品于25mL 容量瓶中，記錄其在pH6. 8 磷酸緩沖液的超聲溶解時間。再分別取17.6mg 地紅霉素腸溶片片粉三份置100mL 容量瓶中，加入pH6.8 磷酸緩沖液，每5min測定一次。結(jié)果表明超聲時間對吸光度無影響RSD=1.01%(n=3)，超聲時間設(shè)置為1 ～2min。

2.1.6 轉(zhuǎn)速的選擇

依據(jù)文獻［9］，轉(zhuǎn)速分別為75 r/min，100 r/min，120 r/min。pH6.8 磷酸緩沖液為溶出介質(zhì)，20 min取樣，過濾，取續(xù)濾液5 mL，以溶出介質(zhì)稀釋至25 mL，測定，計算釋放度。結(jié)果表明在pH6.8 磷酸緩沖液中，轉(zhuǎn)速100r/min 和120r/min 釋放度符合要求(RSD 分別為1.26%和1.12%，n =6)，100r/min更接近胃蠕動頻率，故選擇轉(zhuǎn)速100r/min。

2.2 釋放度測定方法的驗證

2.2.1 專屬性

稱取按處方配制的空白輔料適量，pH6.8 磷酸緩沖液溶解，過濾，取濾液及pH6.8 磷酸緩沖液、硫酸溶液以及硫酸和pH6.8 磷酸緩沖液的混合溶液在190 ～700nm 分別掃描。

圖譜顯示，處方中的輔料、溶出介質(zhì)以及顯色試劑對測定無影響，測定方法專屬。

2.2.2 穩(wěn)定性［9-15］

取同批樣品(121117)3 片，照2.1.1.2 配制供試品溶液，分別于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8 小時取樣測定，記錄吸收值，相對標準偏差0.17%。結(jié)果表明溶液8 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 精密度［9-15］

取地紅霉素腸溶片10 片，精密稱取相當含藥量27.5mg 的粉末，照2.1.1.2 配置溶液;另精密稱取對照品約27.5mg，照2.1.1.1 配置溶液，482nm 測定6 次吸光度，相對標準偏差0.08%。結(jié)果表明方法的精密度高。

2.2.4 線性與范圍［9-15］

精密稱取地紅霉素對照品15.60 mg 于100 mL容量瓶中，加pH6. 8 磷酸緩沖液溶解并稀釋至刻度，過濾。精密取續(xù)濾液1、2、3.5、5、7、9、10mL 于25mL 容量瓶中，加pH6.8 磷酸緩沖液稀釋至刻度，取5mL 置10mL 具塞試管，加5mL 硫酸溶液(75→100mL)，搖勻。482nm 測定。3.12 ～31.2μg/mL，A=0.018C + 0.026，R2=0.999，線性良好。

2.2.5 回收率

(1)地紅霉素腸溶片的含量測定:取地紅霉素腸溶片30 片，分三組，精密稱定，研細。精密稱取相當于地紅霉素27.5mg 的粉末三份，照2.1.1.2 配制，平行取兩份;再精密稱取對照品27. 5mg，照

2.1.1.1 配制，482nm 測定吸光度，釋放度56.79%，相對標準偏差1.66%。

(2)加樣回收率:取已測定含量的地紅霉素腸溶片10 片，研細，精密稱取相當于含藥量27.5mg的粉末三份，分別加入對照品22mg、27.5mg、33mg，照2.1.1.2 加pH6.8 磷酸緩沖液溶解稀釋至刻度，過濾，分別取續(xù)濾液2.5mL 于25mL 容量瓶中，用pH6.8 磷酸緩沖液稀釋至刻度(三份)，再取該液5mL 于10mL 具塞試管，加5mL 硫酸(75→100mL)搖勻;精密稱取對照品27.5mg，照2.1.1.1 配制。482nm 測定吸光度，平均回收率99.18%，相對標準偏差1.18%。

溶出加樣回收率為99.18%，在98% ～102%范圍內(nèi)，相對標準偏差RSD =1. 18% (n =9)，小于2%，符合測定要求。表明樣品地紅霉素的回收率良好。

2.3 溶出測定取樣時間及溶出限度的確定

2.3.1 累積溶出曲線研究

測定方法:37 ±0.5℃，轉(zhuǎn)籃法，100r/min，溶出介質(zhì)為900mLpH6.8 緩沖溶液，3、7、10、13、16、20分鐘取樣10mL，補液10mL(pH6.8 磷酸緩沖液)，精密量取續(xù)濾液5mL 稀釋至25mL，482nm 測定。樣品:121117、121118、121119、參比制劑(湖南九典出品)，由測定結(jié)果繪制累積溶出曲線圖，如圖1。

計算得f2值［15］分別為99、99、99，且樣品溶出曲線基本重合，溶出行為穩(wěn)定，表明與參比試劑溶出曲線極其相似。

2.3.2 均一性

取121117 批樣品，按上述溶出條件，每次6 片，共6 次，測定其在20 min 時的釋放度，結(jié)果見圖2。

圖2 均一性試驗曲線

結(jié)果表明三批樣品在20 min 內(nèi)達到完全溶出，且釋放度均達到95%以上，均一性良好。

根據(jù)以上試驗結(jié)果及對溶出曲線的分析，釋放度的限度規(guī)定為經(jīng)45min，釋放度不得少于80%，而本品顯然在釋放過程中達到釋放度的限度要求。

2.4 溶出方法的確定

取本品，照釋放度測定法［7］，以pH6.8 緩沖液900mL 為溶劑，轉(zhuǎn)速為100r/min，依法操作;20min時，取溶液10mL，過濾，精密量取續(xù)濾液5.0mL，加pH6.8 緩沖液稀釋至25mL，搖勻;另精密稱取地紅霉素對照品適量，加pH6.8 緩沖液溶解并稀釋成每1mL 中約含地紅霉素27.5μg 的溶液;取上述兩溶液，反應(yīng)后，在482nm 波長處分別測定吸收值，計算每片的釋放量。限度為標示量的80%。

以上法測定三批樣品及參比制劑結(jié)果見表10。

表10 三批樣品測定結(jié)果

三批樣品及參比制劑的釋放度均在80%以上。本釋放度測定方法專屬性，準確、靈敏、可靠。

采用pH6.8 磷酸緩沖液、100 r/min 大杯轉(zhuǎn)籃法，硫酸(75 →100)顯色，482nm 測定吸光度的方法，可簡便、專屬、精密、快捷的測定地紅霉素腸溶片的釋放度。

3 討論

圖1 樣品及參比制劑累積溶出曲線

目前地紅霉素腸溶片釋放度的測定方法主要有美國藥典(USP34)中采用了口占噸氫醇顯色法;我國的試行藥品標準中采用了硫酸顯色法;另外，還可以采用含量測定的HPLC 法進行釋放度的測定。對于前者，試劑較難得到，國內(nèi)多數(shù)單位不具備此條件;而對于后者，由于地紅霉素缺乏分析上很好利用的紫外吸收區(qū)，一般采用末端吸收波長進行檢測，這對于分析實驗條件及試劑要求較高。而硫酸顯色法雖然專屬性相對較低，但操作快速簡單。根據(jù)本文考察，對于地紅霉素腸溶片釋放度試驗，硫酸顯色法是一種較好的測定方法。

本文對地紅霉素腸溶片進行釋放度的測定，其測得的結(jié)果均在20min 內(nèi)達到溶出標示量的95%以上，符合《中國藥典》2010 版要求。

由于實驗條件有限，轉(zhuǎn)籃法和漿法的比較在轉(zhuǎn)速上會有差異，并且在美國藥典(USP34)中直接選擇了轉(zhuǎn)籃法，所以最終未通過試驗數(shù)據(jù)來驗證釋放度方法中溶出方式的選擇，而直接選擇了轉(zhuǎn)籃法。

釋放度試驗是區(qū)分藥物固體制劑體外溶出速率的一種手段，它的應(yīng)用指導(dǎo)了新藥的研究，增加了控制藥物質(zhì)量的檢查項目，客觀評價了口服固體制劑，提高了制劑的質(zhì)量。釋放度的研究和應(yīng)用不斷促進了藥物研制水平，強化了藥品質(zhì)量控制手段，在藥物的研制、生產(chǎn)和指導(dǎo)臨床用藥方面具有重要的意義。

溶出相似因子f2計算公式:Ynt= (1/n)，式中Ynt為平均釋放度;YTt)2，Q 為試驗藥品與對照藥品的平均釋放度的方差和;

f2=50 × lg［(1 + Q/n)－0.5×100］，如果50 ≤f2≤100，則表示釋放度相似。

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