HPLC法測(cè)定小柴胡湯劑中黃琴苷的含量*

蘭 雪，唐富山，陳曾妮，張 淵，汪 巍，周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563099)

技術(shù)與方法

HPLC法測(cè)定小柴胡湯劑中黃琴苷的含量*

蘭 雪，唐富山，陳曾妮，張 淵，汪 巍，周旭美

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州遵義 563099)

目的應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定小柴胡湯劑中黃芩昔含量。方法小柴胡湯以水煎法制備，其中黃芩昔的含量用HPLC法進(jìn)行分析，色譜柱為TSKgel ODSC18(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇:水:磷酸(體積比為65∶35∶0.7)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。結(jié)果黃芩昔的線性范圍為0.025～1.6 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=18 533x-724.89，R2=0.9993，平均加樣回收率為94.58%(RSD=1.76%)，穩(wěn)定性考察表明小柴胡湯室溫放置48 h，其中黃芩昔含量穩(wěn)定，小柴胡湯中黃芩昔平均含量為3.39 mg/mL(RSD=1.39%)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，可用于小柴胡湯的質(zhì)量控制。

小柴胡湯;HPLC;黃答普;含量;質(zhì)量控制

小柴胡湯為我國(guó)漢代名醫(yī)張仲景《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，由柴胡、黃芩、人參(現(xiàn)多用黨參代替)、半夏、甘草、生姜、大棗等7味藥材組成，用于治療傷寒少陽(yáng)證，具解表散熱、疏肝和胃的功效。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，小柴胡湯被廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、婦科、兒科、五官科等系統(tǒng)疾病的治療［1］，尤其在治療慢性乙型肝炎、肝纖維化，以及預(yù)防肝癌中多有應(yīng)用［2］。由于中藥制劑藥材來源和提取方式不同等多方面因素，會(huì)對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生一定影響，因此對(duì)尤其是像小柴胡湯這樣應(yīng)用廣泛的中藥制劑，進(jìn)行必要的質(zhì)量控制是當(dāng)前中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。以往文獻(xiàn)［3-4］已對(duì)采用高效液相色譜法測(cè)定小柴胡湯中黃芩昔的含量進(jìn)行過報(bào)道，但從資源節(jié)約、實(shí)驗(yàn)效率提高的角度考慮，尚有必要進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件。為了在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中控制小柴胡湯制劑質(zhì)量，并為類似研究提供參考，本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上改進(jìn)了色譜條件，對(duì)測(cè)定小柴胡湯中黃芩昔含量所應(yīng)用的高效液相色譜法進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得更快速、準(zhǔn)確、適用性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 安捷倫1260型高效液相色譜儀，進(jìn)樣器(G1329B)，四元泵(G1311C)，二極管陣列檢測(cè)器(G1315C)，超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］，純水儀(艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī))。湯劑制備所需藥材購(gòu)自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院生藥教研室楊建文教授鑒定，均為合格藥材。黃芩昔(貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，GZDD-0037)，甲醇、乙醇、磷酸等分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，流動(dòng)相用的甲醇為色譜純，水為雙蒸水。

1.2 色譜條件與溶液配制

1.2.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充的色譜柱TSKgel ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱(Agilent Zorbax Reliance Cartridge Guard-Columns，4.6 mm×12.5 mm)，甲醇:水:磷酸(65∶35∶0.7)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5μl，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.2.2 小柴胡湯劑的制備 小柴胡湯的藥材配伍比例參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》［5］中小柴胡顆粒的比例，制備方法參照蔡皓等［6］通過正交試驗(yàn)得到的小柴胡湯最佳提取方案，采用水提法。具體步驟為:取柴胡12.5 g、黃芩4.5 g、黨參4.5 g、半夏4.5 g、甘草4.5 g、生姜4.5 g、大棗4.5 g，加8倍量的水，煎煮40 min，藥液使用紗布過濾，收集濾液，藥渣繼續(xù)加入8倍量的水，煎煮40 min，藥液以紗布過濾后，合并前后2次的濾液，濃縮至125 mL即得。

1.2.3 溶液的配制 對(duì)照品儲(chǔ)備液制備:精密稱取黃芩昔對(duì)照品16 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻即得。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成系列濃度，分別為1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/mL。

小柴胡湯供試品溶液的制備:精密移取1.2.2項(xiàng)制備的小柴胡湯劑10 mL，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇10 mL，超聲處理30 min，放冷后加甲醇定容，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察 將黃芩昔對(duì)照品用甲醇溶解后進(jìn)樣，如圖1所示，黃芩昔對(duì)照品的出峰時(shí)間為4.87 min;小柴胡湯樣品經(jīng)“1.2.3小柴胡湯供試品溶液的制備”方法處理后進(jìn)樣，如圖2所示，小柴胡湯樣品中黃芩昔的出峰時(shí)間為4.87 min，與黃芩昔對(duì)照品出峰時(shí)間一致。

圖1 黃琴苷對(duì)照品色譜圖

圖2 小柴胡湯樣品色譜圖

2.1.2 線性考察 按照1.2.3項(xiàng)系列濃度溶液的稀釋方法，以濃度為橫坐標(biāo)，以各濃度點(diǎn)的峰面積值為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=18 533x-724. 89，R2=0.999 3，結(jié)果表明峰面積與黃芩昔濃度在黃芩昔濃度為0.025～1.6 mg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照藥材配伍比例稱取各藥材，以1.2.2項(xiàng)方法制備成小柴胡湯樣品，再按照1.2.3項(xiàng)方法制備小柴胡湯供試品，然后進(jìn)樣，測(cè)定峰面積值分別為23 348.3、23 099.7、23 523.8、23 557.0、23 704.8、24 023.5，經(jīng)計(jì)算RSD=1. 33%，小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、6、8、24和48 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積值分別為24 706.0、24 628.2、24 594. 5、24 518.3、24 633.4、24 555.4、24 478.4，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行穩(wěn)定性考察，經(jīng)計(jì)算RSD=0. 31%，小于2%，表明室溫放置48 h，小柴胡湯中黃芩昔比較穩(wěn)定。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，于1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值分別為24 555.4、24 594.5、24 570.3、24 621.5、24 595.7、24 533.4，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到RSD=0.129%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率考察 取該批小柴胡湯樣品9份，每份5mL分別置于25 mL容量瓶中，以每份小柴胡湯樣品中黃芩昔含量的低、中、高不同倍量加入黃芩昔對(duì)照品溶液，再按照1.2.3項(xiàng)操作處理，每組3份進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積值，計(jì)算得到的加樣回收率為94.58%，經(jīng)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2% (見表1)，說明該方法穩(wěn)定可行。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2 小柴胡湯劑中黃答普的含量 取小柴胡湯供試品溶液適量進(jìn)樣后記錄峰面積，計(jì)算得到該種制備方法得到的小柴胡湯中黃芩昔的平均含量為3. 39 mg/mL(見表2)。

表2 小柴胡湯中黃琴苷的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

湯劑在現(xiàn)代臨床用藥過程中仍然被廣泛應(yīng)用，但其質(zhì)量控制大多是通過對(duì)制備過程的經(jīng)驗(yàn)把握來實(shí)施，在提倡中藥現(xiàn)代化的形勢(shì)下，有必要在湯劑的質(zhì)控中逐步引入現(xiàn)代分析方法。由于水提的方法更接近于湯劑臨床用藥實(shí)際，小柴胡湯中主要的藥效成分之一的黃芩昔以水煎煮法為最佳提取方法［7］，因此本試驗(yàn)采用水提法制備小柴胡湯。許多包含有黃芩的中藥復(fù)方都采用黃芩昔的含量測(cè)定進(jìn)行質(zhì)控［8］，2010版《中華人民共和國(guó)藥典》［5］中小柴胡顆粒也以黃芩昔進(jìn)行質(zhì)控，因此本文以改進(jìn)色譜條件的高效液相色譜法測(cè)定小柴胡湯劑中黃芩昔的含量。小柴胡湯中黃芩昔的含量測(cè)定方法已有報(bào)道［9-10］，但各方法都不同程度存在流動(dòng)相毒性大、成本高和分析時(shí)間較長(zhǎng)等問題，如紀(jì)松崗等［11］用高效液相色譜法測(cè)定小柴胡湯中黃芩昔和漢黃芩昔的含量，流動(dòng)相采用乙睛和水，梯度洗脫，黃芩昔的出峰時(shí)間為20 min。本研究采用甲醇和水為流動(dòng)相，黃芩昔在4.87 min出峰，峰形對(duì)稱。乙睛是HPLC的流動(dòng)相的重要選擇之一，但色譜純的乙睛成本較高，而且相對(duì)較大的毒性也是乙睛的一個(gè)缺點(diǎn)。相比之下，本試驗(yàn)中采用色譜甲醇為主的流動(dòng)相，整體改善了色譜條件，不僅經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，而且分析時(shí)間顯著縮短，使得分析方便快捷，并有利于資源的節(jié)約與試驗(yàn)效率的提高。

在流動(dòng)相的調(diào)試過程當(dāng)中，最初參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》［5］小柴胡顆粒中黃芩昔的含量測(cè)定方法中的流動(dòng)相達(dá)不到滿意的分離效果，因此本實(shí)驗(yàn)在預(yù)試甲醇與水的流動(dòng)相比例時(shí)，以藥典方法中的色譜條件為基礎(chǔ)，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(體積比為47∶53∶0.2)時(shí)，存在嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，繼而增大有機(jī)相比例來調(diào)節(jié)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(體積比為80∶20∶0.2)時(shí)，峰位前移，而后面的拖尾小峰不僅沒有消失而且出現(xiàn)了包峰現(xiàn)象，考慮到黃芩昔屬于偏酸性化合物，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相酸度，本文試圖通過改變磷酸在流動(dòng)相中的比例，以改善拖尾現(xiàn)象，為此分別預(yù)試了0.2%、0.5%、0.7%的磷酸濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸濃度為0. 7%時(shí)色譜的拖尾現(xiàn)象明顯改善，考慮到酸度不宜過高以保護(hù)色譜柱，未進(jìn)一步提高磷酸濃度，故使用0.7%的磷酸比例。另外在預(yù)試時(shí)，柱溫的變化也可以改變色譜峰的行為，因而，考察了柱溫變化對(duì)色譜峰的影響，分別預(yù)試了25℃、30℃、35℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度升高可以改善拖尾現(xiàn)象，但當(dāng)35℃時(shí)，并沒有得到更好的分離效果，故選擇30℃作為柱溫。流動(dòng)相中的有機(jī)相也不宜過高，因?yàn)榉逦贿^于前置，可能會(huì)被溶劑峰干擾。當(dāng)色譜條件以甲醇-水-磷酸(體積比為65∶35∶0.7)為流動(dòng)相，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30℃時(shí)，可達(dá)到較為滿意的分離測(cè)定效果。

以中藥制劑中1種或數(shù)種主要效用單體成分作為質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，才能使得中藥制劑在臨床使用，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中換算給藥劑量時(shí)真正做到定量、可控、可重復(fù)。尤其是湯劑，在其制備過程中由于藥材來源不同、濃縮程度等因素的差異，會(huì)造成實(shí)際給藥劑量的差異，從而影響用藥安全或影響試驗(yàn)研究結(jié)論的合理獲取，因而有必要通過簡(jiǎn)單易行的質(zhì)量控制提供給藥劑量的參考依據(jù)。本文參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》［5］小柴胡顆粒的質(zhì)量控制方法，改進(jìn)了有關(guān)色譜條件，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定小柴胡湯中黃芩昔的含量，方法準(zhǔn)確度高、儀器精密度好，具有方便易行、準(zhǔn)確可靠、通用性強(qiáng)的特點(diǎn)，可作為臨床用藥及試驗(yàn)研究中小柴胡湯的質(zhì)量控制方法，并可為有關(guān)制劑的質(zhì)控和研究提供參考。

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［收稿2015-05-14;修回2015-06-20］

(編輯:王福軍)

Determ ination of baicalin in Xiaochaihu decoction by HPLC

Lan Xue，Tang Fushan，Chen Zengni，Zhang Yuan，Wang Wei，Zhou Xumei
(School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

Objective To establish the HPLC method for determination of baicalin in Xiaochaihu decoction. M ethods Xiaochaihu decoction was prepared through extractingmethod of decoction with the prescription according to Xiaochaihu granules in the Chinese Pharmacopoeia(2010 edition)and then baicalin in the Xiaochaihu decoction was determined through column of TSKgel ODSC18(250 mm×4.6 mm，5μm)with column temperature of 30℃，mobile phase ofmethyl alcohol-water phosphoric acid(65:35:0.7)with a flow rate of 1.0 ml/min and at detection wavelength of280 nm.Results A good linearity can be seen from the calibration curve of baicalin in the range of 0.025 mg/ml to 1.6 mg/mlwith R2of0.999 3 and the average recovery was94.58%with RSD of 1.76%.Xiaochaihu decoction was stable in 48 hours after preparation.The average content of baicalin in Xiaochaihu decoction was 3.39 mg/ml(RSD=1.39%).Conclusion HPLC method might be ideally used to the quality control of Xiaochaihu decoction for convenient，highly sensitive，accurate and reliable characteresitic.

Xiaochaihu decoction;HPLC;baicalin;content;quality control

R927.2

A

1000-2715(2015)04-0435-04

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO:黔科合J字［2013］2323)。

唐富山，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:臨床藥學(xué)，E-mail:fstang@zmc.edu.cn;周旭美，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:臨床藥學(xué)，E-mail:546265853@qq.com。