中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410011

EGFR-T790M突變所致吉非替尼耐藥肺腺癌細(xì)胞化療藥物敏感性變化的研究

李學(xué)真，鄒文，馬進(jìn)安，張星南

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410011

背景與目的：EGFR-TKI治療NSCLC失敗后，化療仍可取得一定的治療效果，是可選擇的治療方案之一。核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase，RR)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementstion group 1，ERCC1)、3型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ，TUBB3)分別與吉西他濱、培美曲塞、鉑類藥物及微管類藥物的化療藥物敏感性存在相關(guān)性，可以通過這些分子標(biāo)志物的表達(dá)水平來預(yù)測化療藥物的敏感性。RRMI、TS、ERCC1和TUBB3高表達(dá)患者化療藥物的敏感性降低，低表達(dá)患者化療藥物敏感性增高。本研究擬探討EGFR-T790M突變所致吉非替尼耐藥肺腺癌細(xì)胞對順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞化療藥物敏感性的變化。方法：通過MTT法檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞對順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞的IC50，探討其對上述藥物的化療敏感性。采用液相芯片法，檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA的表達(dá)水平。通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：與PC9細(xì)胞株相比較，PC9/GR細(xì)胞株對吉非替尼、順鉑、吉西他濱和培美曲塞的IC50明顯增高(P＜0.05)；對長春瑞濱、紫杉醇和多西他賽的IC50明顯降低(P＜0.05)。PC9/GR細(xì)胞對吉非替尼、順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞的耐藥指數(shù)分別為70、1.56、1.61、0.34、0.39、0.14和1.71。與PC9細(xì)胞株mRNA的表達(dá)量相比較，PC9/GR細(xì)胞株ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA和TS mRNA的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)，TUBB3的mRNA的表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與PC9細(xì)胞株蛋白的表達(dá)量相比較，PC9/GR細(xì)胞株ERCC1、RRM1和TS的蛋白表達(dá)量明顯增高，TUBB3蛋白的表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：肺腺癌細(xì)胞株發(fā)生EGFR-T790M突變后對化療藥物敏感性發(fā)生變化，對順鉑、吉西他濱和培美曲塞的敏感性降低，對長春瑞濱、紫杉醇和多西他賽的敏感性增高；其化療藥物敏感性發(fā)生變化的原因可能與肺腺癌細(xì)胞株發(fā)生EGFR-T790M突變后ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TS mRNA及其蛋白表達(dá)量發(fā)生變化相關(guān)。

肺腺癌；T790M突變；耐藥；ERCC1；TUBB3；TS；RRM1；化療；

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國，肺癌的發(fā)病率及死亡率亦居各種惡性腫瘤的首位。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)作為肺癌的主要類型，占肺癌患者的85%以上，并且多數(shù)患者確診時已處于晚期，喪失了手術(shù)治療的機(jī)會，需要進(jìn)行化療或分子靶向治療。對于大多數(shù)晚期NSCLC患者，以鉑類為基礎(chǔ)的一線化療有效率僅為20%～30%［1］，療效已達(dá)到平臺期。近年來，隨著肺癌基因分型及分子靶向藥物的發(fā)展，以吉非替尼、厄洛替尼為代表的靶向治療已成為晚期NSCLC內(nèi)科治療的主要手段，并取得驚人效果［2］。但是，即使EGFR-TKI初始治療非常有效的患者，治療一段時間后，最終還是會出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥而導(dǎo)致疾病的進(jìn)展［3］。對于發(fā)生EGFR-TKI治療耐藥的患者該如何優(yōu)化治療方案，是當(dāng)前肺癌臨床治療亟待解決的難題。晚期NSCLC應(yīng)用EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥后，其對化療藥物的敏感性是否有變化，如何選擇對EGFR-TKI耐藥的肺腺癌高效且相對低毒的化療藥物具有重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

PC9為吉非替尼敏感肺腺癌細(xì)胞株，PC9/ GR為采用大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導(dǎo)獲得的吉非替尼繼發(fā)性耐藥肺腺癌細(xì)胞株，由廣州呼吸研究所贈予。RPMI-1640培養(yǎng)液為中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)公司分裝；吉非替尼購自英國 AstraZeneca公司；順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞均購自山東齊魯制藥有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；兔抗人ERCC1、RRM1、TYMS和TUBB3抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗人β-actin抗體、HRP山羊抗鼠IgG抗體亦購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Proteintech液相芯片試劑盒由益善生物技術(shù)股份有限公司提供；液相基因芯片系統(tǒng)和Luminex閱讀儀購自美國Luminex公司。

1.2 MTT法檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞對順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞的IC50

收集對數(shù)期生長的肺腺癌細(xì)胞PC9及PC9/GR，分別制成細(xì)胞懸液后調(diào)整濃度，取3 000個/孔細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的吉非替尼溶液：0、0.00 1、0.005、0.01、0.05、0.5、1、5、10和20 μmol/L；順鉑濃度分別為：0、1、2.5、5、10、15、30、60和120 μmol/L；紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱、吉西他濱、培美曲塞藥物濃度均為0、0.0001、0.001、0.01、0.005、0.1、1、5和20 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)72 h。在加藥第72 h的前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞楓，置搖床上低速振蕩5～10 min，使結(jié)晶充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選用490 nm波長測量各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計算細(xì)胞存活率，再根據(jù)半數(shù)抑制濃度(IC50)值計算耐藥指數(shù)，其中細(xì)胞存活率= (A藥物處理組-A空白對照組)/(A細(xì)胞對照組-A空白對照組)×100%，耐藥指數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。

1.3 液相芯片法檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA的表達(dá)水平

將細(xì)胞離心收集于1.5 mL EP管中，加入裂解液，56 ℃下裂解反應(yīng)2 h。采用美國NanoDrop公司超微量核酸蛋白分析儀檢測裂解液中總mRNA純度。將樣本裂解液轉(zhuǎn)移至溫育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55 ℃震蕩溫育過夜。次日將溫育板放在磁力架上1 min，此時磁性微球聚集在底部，棄去上清液。加入洗滌液，震蕩洗滌 1 min，溫育板放在磁力架上1 min，棄去上清液，重復(fù)洗3次。加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，50 ℃震蕩反應(yīng)1 h。溫育板放在磁力架上1 min，棄去上清液；用洗滌液洗2次。加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50 ℃震蕩反應(yīng)30 min。溫育板放在磁力架上1 min，棄去上清液；用洗滌液洗2次。加入洗滌液，震蕩5 min，于Luminex 閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)［Events：100 Sample Size：50 μL Bead ；Set：20＃；29＃；34＃；36＃；43＃；44＃；45＃；46＃Set：20＃；29＃；34＃；36＃；43＃；44＃；45＃；46＃；SET后的編號為微球編號，不同的微球上包埋有不同的探針，探針和目標(biāo)分子特異的雜交結(jié)合，在液相芯片儀上讀取熒光值，進(jìn)行檢測結(jié)果判定。Gate：8 000～13 500］。數(shù)據(jù)分析，得出檢測結(jié)果；軟件讀取原始結(jié)果顯示為微球中位熒光讀數(shù)，經(jīng)益善生物技術(shù)股份有限公司提供數(shù)據(jù)處理軟件產(chǎn)生最終結(jié)果。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白的表達(dá)水平

PC9和PC9/GR細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)使用說明操作，測定蛋白濃度。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為2 mg/mL，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉l h，0.2% TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入兔抗人ERCC1、RRM1、TS和TUBB3抗體，4 ℃過夜，0.2%TBST洗膜3次，每次10 min，加相應(yīng)的二抗及GAPDH內(nèi)參溫育45～60 min。溫育結(jié)束，TBS-T洗3次，每次15 min。洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的基因和內(nèi)參基因蛋白的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各濃度抑制率分別計算出吉非替尼、順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞對肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9、PC9/GR的IC50以表示上述各化療藥對兩個細(xì)胞株的敏感性。結(jié)果顯示肺腺癌PC9細(xì)胞對吉非替尼、順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞的IC50分別為(0.031±0.007)、(2.657±0.039)、(0.293±0.051)、(0.067±0.005)、(0.018±0.004)、(0.021±0.001)和(0.258±0.013) μmol/L；肺腺癌PC9/GR細(xì)胞對吉非替尼、順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽、培美曲塞的IC50分別為(2.170±0.101)、(4.135±0.177)、(0.471±0.035)、(0.023±0.005)、(0.007±0.001)、(0.003±0.001)和(0.440±0.027) μmol/L。與PC9細(xì)胞株相比較，PC9/GR細(xì)胞株對吉非替尼、順鉑、吉西他濱和培美曲塞的IC50明顯增高(P＜0.05)；對長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽的IC50明顯降低(P＜0.05)。PC9/GR細(xì)胞對吉非替尼、順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽、培美曲塞的耐藥指數(shù)分別為70.00、1.56、1.61、0.34、0.39、0.14和1.71(表1)。

表1 肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞對化療藥物的IC50Tab. 1 The IC50values of cisplatin, gemcitabine, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel, pemetrexed to PC9 and PC9/GR cells

2.2 液相芯片檢測結(jié)果

Luminex閱讀儀讀取微球中位熒光值的數(shù)據(jù)，檢測各基因微球中位熒光值與相應(yīng)對照組微球中位熒光值比值代表mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，PC9細(xì)胞株檢測ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA的相對表達(dá)量分別為0.425±0.000、0.884±0.000、0.413±0.000和0.527±0.000；PC9/ GR細(xì)胞株檢測ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA的相對表達(dá)量分別為0.486±0.002、1.426±0.002、0.284±0.000和0.743±0.000。與PC9細(xì)胞株mRNA的表達(dá)量相比較，PC9/GR細(xì)胞株ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA和TS mRNA表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)，TUBB3 mRNA的表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2，圖1)。

表2 肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞株相關(guān)基因的mRNA表達(dá)Tab. 2 The expressions of ERCC1 mRNA, RRM1 mRNA,TUBB3 mRNA, TS mRNA in PC9 and PC9/GR cells

圖1 液相芯片檢測ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA表達(dá)情況Fig. 1 The expression levels of ERCC1 mRNA, RRM1 mRNA, TUBB3 mRNA and TS mRNA in PC9 and PC9/GR cells

2.3 Western blot檢測結(jié)果

利用凝膠成像系統(tǒng)分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，以各組待測蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示各組待測蛋白的表達(dá)量。PC9細(xì)胞株ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白相對表達(dá)量分別為54.237±11.724、45.713±0.770、62.164±1.743和44.146±13.025；PC9/GR細(xì)胞株ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白表達(dá)量分別為72.463±4.045、65.843±8.265、35.654±2.731和65.531±5.266；與PC9細(xì)胞株蛋白的表達(dá)量相比較，PC9/GR細(xì)胞株ERCC1、RRM1和TS的蛋白表達(dá)量明顯增高，TUBB3的蛋白表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表3、圖2)。

表3 肺腺癌PC9、PC9/GR細(xì)胞株相關(guān)基因的蛋白表達(dá)情況Tab. 3 The expressions of TUBB3, TS and RRM1 protein in PC9 and PC9/GR cells

圖2 Western blot檢測ERCC1、RRM1、TUBB3和TS蛋白的表達(dá)Fig. 2 The expressions of ERCC1, RRM1,TUBB3 and TS protein in PC9 and PC9/GR cells by Western blot

3 討 論

近年來，分子靶向治療已成為NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療，具有低毒高效的優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用靶向治療出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥后改用化療仍然可取得較好的臨床療效。導(dǎo)致NSCLC靶向治療過程中產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的機(jī)制多種多樣，如EGFR二次突變(T790M突變)［3］、MET基因擴(kuò)增［4］、IGF-IR下調(diào)［5］、向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化［6-7］、PTEN缺失［8］等。不同機(jī)制導(dǎo)致產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的NSCLC改行化療時應(yīng)該如何選擇高效的化療方案，值得深入研究。

本研究中，液相芯片檢測顯示PC9細(xì)胞株EGFR19外顯子缺失突變(delE746-A750)； PC9/GR細(xì)胞株不僅存在EGFR19外顯子缺失突變(delE746-A750)，同時存在EGFR20外顯子T790M突變。本研究應(yīng)用MTT法檢測PC9及PC9/GR細(xì)胞株對順鉑、吉西他濱、長春瑞濱、紫杉醇、多西他賽和培美曲塞的IC50，分別應(yīng)用液相芯片法和Western blot法檢測上述藥物化療敏感性相關(guān)基因ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA、TUBB3 mRNA和TS mRNA，及其蛋白的表達(dá)情況。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC9/GR細(xì)胞株對順鉑、吉西他濱和培美曲塞的IC50較PC9細(xì)胞株明顯增高，其對長春瑞濱、紫杉醇和多西他賽IC50較PC9細(xì)胞株明顯降低。同時，與PC9細(xì)胞株相比，PC9/GR細(xì)胞株ERCC1 mRNA、RRM1 mRNA和TS mRNA及蛋白表達(dá)量明顯升高，其TUBB3 mRNA及蛋白含量明顯降低。說明PC9/GR細(xì)胞株較PC9細(xì)胞株對順鉑、吉西他濱和培美曲塞的藥物敏感性明顯降低，產(chǎn)生了不同程度的耐藥；而對抗微管類藥物長春瑞濱、紫杉醇和多西他賽的敏感性增高。Wu等［9］回顧性分析了195例肺癌患者，這部分患者一線應(yīng)用吉非替尼耐藥后，改行化療，其有效率為27%，其中以鉑類為基礎(chǔ)或者以紫杉類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，其有效率明顯高于單藥或者其它化療方案的有效率，其中紫杉類聯(lián)合鉑類藥物的有效率最高，達(dá)50.0%。另外，鄧沁芳等［10］進(jìn)行基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼獲得性耐藥的肺腺癌細(xì)胞株與親代非耐藥細(xì)胞株相比，其對順鉑敏感性明顯減弱，對多西他賽敏感性增強(qiáng)，這與本研究的結(jié)果一致。此外，鄧沁芳等［10］的研究中，耐吉非替尼細(xì)胞株與非耐藥細(xì)胞株對培美曲塞的敏感性無明顯變化，其原因可能是由于該研究中應(yīng)用的細(xì)胞株是致突變劑及吉非替尼短時間內(nèi)誘導(dǎo)突變導(dǎo)致的吉非替尼耐藥細(xì)胞株，并未對其進(jìn)行耐藥機(jī)制的檢測，其產(chǎn)生耐藥的機(jī)制并不明確，而本研究的PC9/GR細(xì)胞株對吉非替尼耐藥是由EGFRT90M突變導(dǎo)致的，兩者可能存在耐藥機(jī)制及其它方面的不同。本研究中經(jīng)吉非替尼治療發(fā)生耐藥后，對順鉑、吉西他濱和培美曲塞敏感性降低可能分別與ERCC1、RRM1及TS表達(dá)量明顯升高有關(guān)。TUBB3 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯降低，可能是紫杉類藥物化療敏感性增高的原因。而對以微管蛋白Ⅲ為基礎(chǔ)的紫杉類化療藥物敏感性提高，原因可能與PC9細(xì)胞株產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥后，細(xì)胞株P(guān)-170蛋白表達(dá)水平降低相關(guān)。

本研究結(jié)果提示，使用吉非替尼導(dǎo)致EGFR-T790M突變發(fā)生繼發(fā)性耐藥后，改行化療時，建議應(yīng)用以紫杉類為基礎(chǔ)的化療方案，避免使用吉西他濱及鉑類為基礎(chǔ)的化療方案。

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The research on the change of chemosensitivity of gefitinib-resistant lung adenocarcinoma cell causedby EGFR-T790M mutation

LI Xuezhen, ZOU Wen, MA Jin’an, ZHANG Xingnan (Department of Oncology, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha Hunan 410011, China)

ZOU Wen E-mail: zouwen29w@126.com

Background and purpose:Chemotherapy is an alternative treatment option, which could still get a therapeutic effect, when the EGFR-TKI treatment of non-small cell lung cancer failed. Studies have shown that RR, TYMS, ERCC1 and TUBB3 have respectively relationship with chemosensitivity of gemcitabine, pemetrexed, platinum-based drugs and microtubule-based chemotherapy drugs.The expression levels of these molecular markers can predict the sensitivity of these chemotherapy drugs. The patients with RRMI, TS, ERCC1 and TUBB3 higher expression have reduced chemosensitivity, and lower expression have increased sensitivity. The purpose of this study was to explore the sensitivity of tumor cell lines with acquired resistance to geftinib caused by EGFR-T790M mutationto cisplatin, gemcitabine, pemetrexed, vinorelbine, paclitaxel and docetaxel.Methods:MTT assay was used to detect the IC50values of cisplatin, gemcitabine, vinorelbine, paclitaxel and docetaxel, pemetrexed to PC9 and PC9/GR cells, and to explore the chemosensitivity of lung adenocarcinoma cells to these chemotherapy drugs; Luminex method was used respectively to detect the expression levels of ERCC1 mRNA, TUBB3 mRNA, TS mRNA, and RRM1 mRNA in PC9 and PC9/GR cells. Western blot was used to detect the protein expression levels of ERCC1, TUBB3, TS and RRM1 in PC9 and PC9/GR cells.Results:The IC50values of cisplatin, gemcitabine and pemetrexed to PC9/GR cells were signifcantly higher than those to PC9 cells (P＜0.05), while the IC50values of vinorelbine, paclitaxe and docetaxel to PC9/GR cells were signifcantly decreased (P＜0.05). Luminex method showed the expressions of ERCC1 mRNA, TS mRNA and RRM1 mRNA in PC9/GR cells were signifcantly increased than those in PC9 cells (P＜0.05), while the expression of TUBB3 mRNA was signifcantly decreased (P＜0.05). Western blot method showed the expressions of TUBB3, TS and RRM1 protein in PC9/GR cells were signifcantly increased than those in PC9 cells (P＜0.05), while TUBB3 protein expression in PC9/GR cells was signifcantly decreased (P＜0.05). Western blot method analysis result showed that the expressions of TUBB3, TS and RRM1 protein in PC9/GR cells were significantly increased than those in PC9 cells (P＜0.05), while TUBB3 protein expression in PC9/GR cells was signifcantly decreased (P＜0.05).Conclusion:The chemosensitivity of lung adenocarcinoma with EGFR-T790M mutation is changed. It has decreased sensitivity to cisplatin, gemcitabine, pemetrexed and increased sensitivity to vinorelbine, paclitaxel and docetaxel. The reason of the change of chemosensitivity of geftinib-resistant lung adenocarcinoma cell maybe related to the changes of ERCC1 mRNA, RRM1 mRNA and TS mRNA and their protein expressions.

Adenocarcinoma; EGFR-T790M mutation; Gefitinib-resistant; ERCC1; TUBB3; TS; RRM1; Chemotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.02.008

R734.2

A

1007-3639(2015)02-0129-06

2014-02-01

2014-12-20）

鄒文 E-mail:zouwen29w@126.com