劉抗寒,劉 芳,梁玉梅,饒 慧,陳 瑩,曾清華

(湖南省人民醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科,長沙 410005)

論著·基礎(chǔ)研究

外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白乙酰化在狼瘡性腎炎中的作用*

劉抗寒,劉 芳,梁玉梅△,饒 慧,陳 瑩,曾清華

(湖南省人民醫(yī)院腎臟風(fēng)濕免疫科,長沙 410005)

目的研究狼瘡性腎炎(LN)患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；?，探究其在LN發(fā)病中的作用。方法18例LN患者均來自該科病房，全部患者都達(dá)到美國風(fēng)濕學(xué)會1997年推薦的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。滿足以下條件為活動性的LN，蛋白尿大于0.5 g/d，或活動性尿沉渣改變(血尿紅細(xì)胞超過5個/Hp，或膿尿白細(xì)胞大于5個/Hp，或細(xì)胞管型大于1個/Hp)，血肌酐升高大于1.2 mg/L，排除感染、腎結(jié)石和其他原因引起的。非活動的LN:蛋白尿小于0.5 g/L，非活動性的尿沉渣。將LN患者分為兩組:非活動性(I組)8例、活動性的LN組(A組)10例，對照組(N組)8例。分別采集LN患者和N組的外周血50 mL，密度梯度離心法(Ficoll法)分離出外周血中的單個核細(xì)胞，采用免疫磁珠技術(shù)分選出CD4+T細(xì)胞，并提取組蛋白，采用組蛋白H3/H4乙?；瘷z測試劑盒檢測組蛋白H3/H4的乙?；?，分析組蛋白H3/H4乙?；郊芭c疾病的關(guān)系。結(jié)果(1)與N組相比，A和I組LN患者外周血CD4+T細(xì)胞的組蛋白H3、H4均呈低乙?；癄顟B(tài)(P<0.01)；(2)A組的組蛋白H4的乙?；降陀贗組(P<0.01)，而組蛋白H3乙?；絻山M間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)組蛋白H4的乙?；脚c24 h尿蛋白排泄量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.661，P<0.05)。結(jié)論在LN患者中的CD4+T細(xì)胞組蛋白H3和組蛋白H4均呈低乙?；癄顟B(tài)可能參與了LN的發(fā)病， CD4+T細(xì)胞組蛋白H4的乙?；娇赡芘cLN的活動性有關(guān)。

組蛋白類；乙?；饔?；狼瘡腎炎；蛋白尿

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)常見并發(fā)癥，也是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因[1]。CD4+T細(xì)胞具有調(diào)控、輔助免疫應(yīng)答作用，對CD8+T細(xì)胞的激活和增殖發(fā)揮輔助作用，在SLE發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[2]。近年來，表觀遺傳學(xué)是SLE發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)，組蛋白乙?；揎梾⑴c了SLE的發(fā)病。本研究旨在研究LN患者中外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白乙?；剑骄科湓贚N發(fā)病中可能的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 18例LN患者均來自本科病房，全部患者都達(dá)到美國風(fēng)濕學(xué)會(American college of rheumatology,ACR)1997年推薦的SLE的分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。參照文獻(xiàn)對LN的分類標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，滿足以下條件為活動性的LN，蛋白尿大于0.5 g/d，或活動性尿沉渣改變(血尿紅細(xì)胞大于5個/Hp，或膿尿白細(xì)胞大于5個/Hp，或細(xì)胞管型大于1個/Hp)，血肌酐升高大于1.2 mg/L，并排除感染、腎結(jié)石和其他原因引起的。非活動的LN:蛋白尿小于0.5 g/L,非活動性的尿沉渣。將LN患者分為兩組，非活動性的LN組(inactive group， I組)，患者10例，活動性的LN組(active group，A組)，患者8例。對照組(normal group，N組)8例，均來自本院的健康醫(yī)務(wù)人員。組間的性別、年齡均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LN患者和N組的一般資料見表1。

表1 LN患者和N組的一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 分離外周血中的單個核細(xì)胞 抽取18例LN患者和8例對照組外周血50 mL，使用密度梯度離心法來分離50 mL外周血中的單個核細(xì)胞。

1.2.2 免疫磁珠技術(shù)純化分離單個核細(xì)胞中的CD4+T淋巴細(xì)胞 (1)接著上面分離單個核細(xì)胞的步驟棄上清液之后，用移液槍吸取PBS 1 000 μL打勻細(xì)胞，將混勻后的液體移入一個干凈的新的50 mL離心管中，再用相同的方法繼續(xù)用PBS洗細(xì)胞，清洗3次之后，全部都收集到50 mL的離心管中，之后再加滿PBS；(2)在4 ℃、2 000 r/min離心10 min，棄上清液后，在避光條件下加入新鮮的buffer溶液320 μL(10 mL血液加入80 μL buffer 溶液)，充分混勻后，加入CD4+T細(xì)胞磁珠(Miltenyi公司，德國)80 μL(10 mL血液加入20 μL buffer 溶液)，充分混勻，在4 ℃的冰箱中避光條件下孵育15 min；(3)孵育之后取出離心管后，加入buffer溶液至總?cè)萘窟_(dá)15～20 mL；(4)在4 ℃、320×g離心10 min，棄上清液，將分選CD4+T細(xì)胞的磁柱放在磁力架上，同時用移液槍吸取3 mL的buffer溶液潤濕磁柱，下接干凈的新的50 mL的離心管；(5)在棄上清的離心管中加入600 μL的buffer溶液，吹打混勻后轉(zhuǎn)入柱中過磁；(6)待滴盡后將3 mL的buffer溶液加入離心管中，充分洗凈混勻后再次轉(zhuǎn)入柱中過磁，并反復(fù)重復(fù)2次，為了盡量減少丟失離心管中的單個核細(xì)胞；(7)全部滴盡后取下磁珠置于一支新的15 mL的離心管，加入5 mL的buffer溶液于磁珠中，快速加壓打盡，新的15 mL離心管中的溶液即為CD4+T細(xì)胞，原來離心管中的事雜細(xì)胞；(8)將收集的5 mL的CD4+T細(xì)胞均勻分裝到3個新的Ep管中，在離心機(jī)中2 500 r/min中離心3 min，棄上清液后再次離心2 500 r/min 1 min，以便完全棄掉buffer溶液，用移液槍吸取多余的水分，防止細(xì)胞降解；(9)將離心后的Ep管放入-80 ℃的冰箱中保存，為下一步的提取組蛋白做準(zhǔn)備。

1.2.3 提取組蛋白 按照EpiQuikTMtotal histone extraction kit試劑盒的說明書提取CD4+T細(xì)胞組蛋白。

1.2.4 檢測組蛋白H3和組蛋白H4乙酰化 采用EpiQuikTMtotal histone H3 Acetylation Detection Fast Kit (Colorimetric)試劑盒檢測組蛋白H3的乙?；珽piQuikTMtotal histone H4 Acetylation Detection Fast Kit (Colorimetric)檢測組蛋白H4乙?；?，采用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光值(OD值)；計算組蛋白H3、H4乙酰化:組蛋白H3(H4)乙?；?=OD(樣本組-空白對照組)/OD(標(biāo)準(zhǔn)對照組-空白對照組)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H3和組蛋白H4乙酰化水平的比較 與N組相比，I組和A組LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H3均呈低乙?；癄顟B(tài)(P<0.01)；與I組比較，A組LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H3乙?；潭冉档停町悷o統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2，圖1。與N組相比，I組和A組LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H4均呈低乙酰化狀態(tài)(P<0.01)；A組LN患者組蛋白H4的乙酰化水平比I組患者的明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2 各組外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；某潭?/p>

圖1 3組蛋白乙酰化水平比較

圖2 CD4+T細(xì)胞組蛋白H4乙?；脚c24 h尿蛋白排泄的相關(guān)性分析

2.2 LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H3、H4乙?；乃脚c24 h尿蛋白排泄量的相關(guān)性分析 LN患者外周血CD4+T細(xì)胞組蛋白H4乙?；脚c24 h尿蛋白排泄量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.661，P<0.01)，見圖2。

3 討 論

LN是SLE的最常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥，是SLE患者死亡的常見病因[1]。SLE是患者體內(nèi)內(nèi)源性的B淋巴細(xì)胞過度活化，導(dǎo)致產(chǎn)生大量的抗體，尤其是針對自身機(jī)體的DNA、RNA及與他們結(jié)合的蛋白產(chǎn)生抗體，而這個過程是在T細(xì)胞介導(dǎo)下產(chǎn)生的適應(yīng)性的免疫應(yīng)答過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞在SLE的發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用[2,6-7]。

組蛋白的修飾方式在SLE疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起很重要的作用[8-10]。Mishra等[11]給MRL-lpr/lpr 小鼠注射組蛋白去乙?；敢种苿?如TSA和SAHA)，導(dǎo)致細(xì)胞中的組蛋白H3和組蛋白H4的乙?；睦鄯e增加，從而下調(diào)脾細(xì)胞中的IL-12、IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA和蛋白質(zhì)的水平，進(jìn)而影響了基因轉(zhuǎn)錄，而MRL-lpr/lpr小鼠的臨床表現(xiàn)明顯減輕，如蛋白尿的量減少、腎小球腎炎癥狀緩解和脾臟的體積減輕等方面。Garcia等[12]給狼瘡小鼠注射HDI(組蛋白去乙酰化酶抑制劑，TSA)，發(fā)現(xiàn)可以控制狼瘡的活動性，蛋白尿和免疫復(fù)合物在腎小球中的沉積減少，脾臟的重量減輕。Reilly等[13]的實驗也證實了在狼瘡小鼠體內(nèi)注射HDI(ITF2357，10 mg/kg)注射可以減輕腎臟疾病癥狀和減少炎癥因子，這主要是通過改變T細(xì)胞的亞型和T細(xì)胞的乙酰化來減輕疾病的臨床癥狀。Zhou等[14]在研究SLE患者中也發(fā)現(xiàn)，患者CD4+細(xì)胞存在組蛋白低乙?；癄顟B(tài)。

本研究觀察了16例LN患者，采用免疫磁珠分選高純度的CD4+T細(xì)胞，提取組蛋白后，檢測組蛋白的乙?；潭?。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LN患者的CD4+T細(xì)胞中的組蛋白H3和組蛋白H4呈低乙?；癄顟B(tài)，提示LN患者CD4+T細(xì)胞中同樣存在組蛋白的低乙?；癄顟B(tài)。活動性LN患者的組蛋白H4乙?；黠@低于非活動性的LN患者；同時，組蛋白H4乙酰化程度與24 h尿蛋白排泄量成負(fù)相關(guān)，提示CD4+T細(xì)胞乙?；癄顟B(tài)可能與LN活動性、尿蛋白排泄量有關(guān)。結(jié)合既往動物實驗研究結(jié)果，干預(yù)CD4+T細(xì)胞組蛋白H4乙酰化水平可能可以誘導(dǎo)LN患者緩解。然而與既往研究不同的是，本研究中發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞中的組蛋白H3的乙?；接兴档?，但與LN的活動性無關(guān)，推測可能存在以下幾種可能:(1)本研究中LN的活動性標(biāo)準(zhǔn)與其他研究中采用的SLEDAI評分不一致，導(dǎo)致結(jié)果有區(qū)別；(2)LN患者CD4+T細(xì)胞中的組蛋白H3的乙?；脚cSLE無腎臟受累的患者本身存在區(qū)別；(3)樣本量較小，存在研究偏倚。

本研究存在的不足:僅觀察了LN患者CD4+T細(xì)胞乙?；乃剑礄z測血漿中HAT和HDAC等活性，由于目前研究處于初步階段，不能進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)實驗。CD4+T細(xì)胞乙?；cLN的關(guān)系有待進(jìn)一步的實驗研究。

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The histone acetylation of CD4+T cells of peripheral blood in the lupus nephritis*

LiuKanghan,LiuFang,LiangYumei△,RaoHui,ChenYing,ZengQinghua

(DepartmentofNephrologyandRheumatology,HunanProvicialPeople′sHospital,Changsha,Hunan410005,China.)

Objective To study the histone acetylation level of CD4+T cells in peripheral blood of lupus nephritis,to explore the role of histone acetylation in pathogenesis of lupus nephritis.MethodsAccording to Feng X,Bernstein,Wagner S J and other scholars′s classification criteria for LN,those who met the following conditions considered for the activity of LN:proteinuria >0.5 g/d,change or activity of urinary sediment (hematuria > 5 red blood cell / Hp,or pyuria > 5 Hp white blood cells,or 1 cell type /Hp),serum creatinine increased >1.2 mg/L,and the exclusion of infection,kidney stones and other causes.Lupus nephritis patients were divided into inactive group (group I) 8 people,active group (group A) 10 people.18 patients with LN and 8 normal controls were collected peripheral blood 50 mL,density gradient centrifugation method (Ficoll method) for separation of mononuclear cells in peripheral blood;CD4+T cell was analyzed by immunomagnetic beads,extracted histone acetylation level and detected H3/H4 protein by the acetylation of histone H3/H4 kits and the relationship of histone H3/H4 acetylation with diseases was analyzed.ResultsFirst,compared with group N,the histone H3 and H4 of CD4+T cells in peripheral blood both in A and I of group LN patients showed low acetylation status (P<0.01);Second,the acetylation level of histone H4 in group A was lower than that in group I (P<0.01),histione H3 acetyl the level of the group of two groups had no statistical significant (P>0.05).Third,it was negatively related to the acetylation level of histone H4 and 24 h urinary protein excretion(r=-0.661,P<0.05).ConclusionHistone H3 and histone H4 of the CD4+T cells showed low acetylation may be involved in the pathogenesis of lupus nephritis.The acetylation level of histone H4 in CD4+T cells may be related to the activity of the LN.

histones;acetylation;lupus nephritis;proteinuria

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.006

湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)青年基金資助(2011-7)。

:劉抗寒(1979-)，博士，主治醫(yī)生，主要從事慢性腎功能不全的防治?！?/p>

，Tel:13574895959；E-mail:liangyumei@aliyun.com。

R593.24+2

A

1671-8348(2015)30-4193-03

2015-04-23

2015-06-30)