煙草WRKY—R1基因的克隆及瞬時(shí)表達(dá)分析

胡曼+宋丹丹+楊金淼+劉衛(wèi)群

摘要：以煙草根尖組織cDNA為模板，RT-PCR結(jié)合電子克隆得到NtWRKY-R1基因的完整ORF，序列分析顯示，NtWRKY-R1具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族典型的WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域及C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第Ⅱ類。采用生物信息學(xué)方法對(duì)NtWRKY-R1蛋白的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系和磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明，NtWRKY-R1與茄科植物保守結(jié)構(gòu)域的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近；磷酸化位點(diǎn)分析顯示該蛋白可能通過(guò)磷酸化作用修飾，進(jìn)而對(duì)其相應(yīng)的代謝活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體、建立瞬時(shí)表達(dá)分析體系，結(jié)果顯示，NtWRKY-R1基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致JA信號(hào)途徑標(biāo)記基因PDF1.2及煙堿合成關(guān)鍵酶基因PMT1表達(dá)量降低，推測(cè)NtWRKY-R1基因影響JA信號(hào)途徑，進(jìn)而調(diào)控?zé)焿A合成。

關(guān)鍵詞：煙草； NtWRKY-R1；基因克隆；生物信息學(xué)分析；瞬時(shí)表達(dá)分析；信號(hào)途徑

中圖分類號(hào)：S572.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2014）09-0012-06

WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，因含有7個(gè)氨基酸組成的高度保守的WRKYGQK序列而得名。研究發(fā)現(xiàn)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生物[1～3]、非生物[4，5]脅迫應(yīng)答，植物衰老[1]和器官發(fā)育[6]等一系列生理活動(dòng)。目前，有關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究已取得很大進(jìn)展，但主要集中在基因克隆、表達(dá)及通過(guò)功能缺陷或超表達(dá)研究其功能，對(duì)其介導(dǎo)的植物應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程、逆境脅迫下的反應(yīng)調(diào)控機(jī)制等仍然不清楚。

煙株打頂是一項(xiàng)重要的農(nóng)藝措施，打頂后，煙草葉中的煙堿合成量增加。有研究表明，打頂可誘發(fā)煙堿生物合成增加是煙株響應(yīng)傷害信號(hào)和激素水平改變等綜合效應(yīng)的結(jié)果。機(jī)械傷害誘導(dǎo)第二信使茉莉酸（JA）產(chǎn)生，JA信號(hào)途徑誘導(dǎo)煙堿合成關(guān)鍵酶腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PMT）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）基因轉(zhuǎn)錄水平升高，促進(jìn)煙堿的生物合成[12]。本課題組從煙草打頂前、后根尖組織消減抑制雜交（SSH）cDNA文庫(kù)中篩選出一條wrky-like的EST（HO059652）序列[7]，采用電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法克隆到該基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)及瞬時(shí)表達(dá)分析，為探討煙株打頂后煙堿合成能力增加的調(diào)控機(jī)制及該轉(zhuǎn)錄因子在地上部傷害刺激誘導(dǎo)根系次生代謝產(chǎn)物積累的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料供試煙草品種K326（Nicotiana tabacum L.cv. K326）。

1.1.2菌株、載體與主要試劑大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和植物表達(dá)載體pROK2由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIzol、MLV、pMDTM19-T Vector、纖維素酶等購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄選取生長(zhǎng)5～6周的實(shí)驗(yàn)室栽培煙草K326植株，TRIzol法提取煙草根尖組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，提取和反轉(zhuǎn)錄方法均參照試劑說(shuō)明書。

1.2.2NtWRKY-R1基因的電子克隆以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的煙草打頂前、后的SSH cDNA文庫(kù)中篩選出的一條WRKY類轉(zhuǎn)錄因子EST序列（HO059652）為查詢探針，在煙草的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢搜索，最后拼接得到一條含有完整ORF的cDNA序列。以此序列設(shè)計(jì)特異引物，以煙草根尖組織cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列F：5′-GCTAGGATCCCATGGATGGAAGATTCAAT-3′（劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）；R： 5′-TAGGTACCTCAGCCCGTGGTCCCACAC-3′（劃線處為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMDTM 19-T Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，鑒定并測(cè)序。

1.2.3NtWRKY-R1的生物信息學(xué)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST得到擬南芥（AAS79556）、辣椒（AAZ99027）、馬鈴薯（ABU49724）、大豆（ABS18444）、蓖麻（XP_002522247）、棉花（ACD56629）、小麥（ABO15543）、水稻（DAA05131）的WRKY氨基酸序列。

依據(jù)MEGA 4.1軟件對(duì)所獲得氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域與NtWRKY-R1的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性比對(duì)和聚類分析；NtWRKY-R1蛋白的理化性質(zhì)、磷酸化修飾和親水性/疏水性分析分別用ProtParam、NetPhos 2.0 Server和ProtScale分析，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)用Scansite、SOPMA在線工具完成。

1.2.4NtWRKY-R1瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHⅠ和KpnⅠ同時(shí)雙酶切質(zhì)粒pROK2和pMDTM19-T-NtWRKY-R1，回收目的片段；用T4 DNA連接酶16℃、過(guò)夜連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建融合質(zhì)粒pROK2-NtWRKY-R1。熱激法將此融合質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，Kan抗性篩選和菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆子。

1.2.5瞬時(shí)表達(dá)分析參照Sheen lab給出的原生質(zhì)體制備和PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[13]的方法制備并轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，作為對(duì)照的原生質(zhì)體、原生質(zhì)體與兩種質(zhì)粒的混合液分別置于光照培養(yǎng)箱中，孵育6～18 h，用布氏漏斗和真空泵盡可能多地除去細(xì)胞中培養(yǎng)基，TRIzol法提取RNA，Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，半定量RT-PCR檢測(cè)PDF1.2、PMT1和NtWRKY-R1基因的瞬時(shí)表達(dá)水平。PDF1.2引物為PDF1.2-F：5′-GCGCCACACAACACATACATCTATACATTG-3′，PDF1.2-R：5′-GCGCCGGTATTTTTATATTATTGTAACAACAA-3′；PMT1引物為PMT1-F：5′-GCCCTGAACACCTCAACGGCTAC-3′，PMT1-R：5′-GCGTTCGATTGAAGGATAACGAAGCATT-3′；以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物為Actin-F：5′-ATGGCGGATGGGGAGGACAT-3′，Actin-R：5′-TTAGAAGCATTTGCGGTG-3′。endprint

2結(jié)果與分析

2.1NtWRKY-R1基因的克隆及序列分析

表明，NtWRKY-R1基因ORF全長(zhǎng)915 bp，編碼304個(gè)氨基酸，編碼蛋白具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族典型的保守結(jié)構(gòu)域和高度保守的7個(gè)氨基酸殘基WRKYGQK（圖2）。

2.2NtWRKY-R1蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1不同WRKY蛋白的同源性比對(duì)及進(jìn)化分析通過(guò)同源性比對(duì)（圖3）發(fā)現(xiàn)不同物種來(lái)源的WRKY之間有高度的同源性，并且NtWRKY-R1與茄科植物保守結(jié)構(gòu)域的同源性均達(dá)到85%。系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖4）顯示，NtWRKY-R1蛋白與茄科植物聚類在一起，而與其它非茄科植物距離較遠(yuǎn)。

2.2.2NtWRKY-R1蛋白的理化性質(zhì)分析NtWRKY-R1蛋白含有304個(gè)氨基酸，分子量為34.21 kD，等電點(diǎn)為5.69，在酸性范圍內(nèi)，屬親水蛋白。

2.2.3NtWRKY-R1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)用SOPMA預(yù)測(cè)NtWRKY-R1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），結(jié)果顯示，α-螺旋占21.71%；β-折疊為9.87%；β-轉(zhuǎn)角最少，僅為3.62%；其余為無(wú)規(guī)則卷曲。這些二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成NtWRKY-R1的基本結(jié)構(gòu)。

2.2.4NtWRKY-R1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析利用NetPhos 2.0 Server 在線分析NtWRKY-R1蛋白的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果（圖6）表明，該蛋白共有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中18個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，4個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)。

2.3NtWRKY-R1瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定融合載體pROK2-NtWRKY-R1，獲得大小約915 bp條帶（圖7），證實(shí)重組子含有目的基因，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確。菌液PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌落（圖8），PCR產(chǎn)物大小約915 bp，證明轉(zhuǎn)化成功。

2.4煙草原生質(zhì)體制備及NtWRKY-R1基因瞬時(shí)表達(dá)分析

在光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的原生質(zhì)體（圖9），煙草葉片酶解去除細(xì)胞壁后呈圓球形，細(xì)胞膜周圍分布有綠色的葉綠體，中間透明的為中央大液泡，少許雜質(zhì)為降解的細(xì)胞壁及胞間組織。

PDF1.2、PMT1、NtWRKY-R1基因瞬時(shí)表達(dá)情況見圖10。PDF1.2是響應(yīng)JA信號(hào)的關(guān)鍵基因，PMT1是煙堿合成關(guān)鍵酶PMT基因家族的代表，NtWRKY-R1的表達(dá)量增加而PDF1.2的表達(dá)量下降，說(shuō)明NtWRKY-R1能夠影響煙草JA信號(hào)途徑的響應(yīng)。同時(shí)PMT1的表達(dá)量下降，表明NtWRKY-R1能夠負(fù)調(diào)控PMT1基因的表達(dá)，抑制煙堿的生物合成。

1：對(duì)照，即未經(jīng)轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體；2：轉(zhuǎn)化空載體pROK2的原生質(zhì)體；3：轉(zhuǎn)化pROK2-NtWRKY-R1過(guò)表達(dá)載體的原生質(zhì)體

3結(jié)論與討論

通過(guò)電子克隆結(jié)合RT-PCR方法克隆煙草根尖組織獲得NtWRKY-R1基因，序列分析顯示其N端具有典型WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，C端有鋅指類似結(jié)構(gòu)，表明從煙草根尖組織中克隆得到了典型的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析，NtWRKY-R1在進(jìn)化關(guān)系上與茄科植物最近。有研究發(fā)現(xiàn)WRKY蛋白可能處于MAP激酶（MAPK）的下游，其功能受MAPK的修飾。Shen等[9]發(fā)現(xiàn)，水稻OsWRKY30與OsMPK3在體外、體內(nèi)都可以直接互作，且OsWRKY30可被OsMPK3、OsMPK7和OsMPK14體外磷酸化，說(shuō)明OsWRKY30是水稻MPKs途徑中重要的底物。Erik等[8]發(fā)現(xiàn)擬南芥MAPK4可激活A(yù)tWRKY25和AtWRKY33，且MAPK4能在體外磷酸化這兩個(gè)蛋白。此外，也有研究證明煙草MAPK或參與調(diào)節(jié)WRKY的活性[10，11]。NtWRKY-R1轉(zhuǎn)錄因子磷酸化位點(diǎn)的分析顯示，其多肽序列中有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白響應(yīng)地上部傷害刺激的過(guò)程可能是一個(gè)磷酸化的過(guò)程，進(jìn)而對(duì)其相應(yīng)的代謝活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

前人研究表明，煙堿合成主要受關(guān)鍵酶ODC、PMT、QPT、MPO、A622調(diào)控，而JA可以調(diào)控PMT基因（NsPMT）和MPO基因的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而控制其表達(dá)，因此，JA是煙堿生物合成過(guò)程中關(guān)鍵的激素調(diào)控因子[14]，且該信號(hào)途徑激活之后會(huì)誘導(dǎo)防御基因PR4、Thi2.1和PDF1.2的表達(dá)等[15]。瞬時(shí)表達(dá)NtWRKY-R1的試驗(yàn)結(jié)果顯示，NtWRKY-R1的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致JA信號(hào)途徑關(guān)鍵防御基因PDF1.2和煙堿合成關(guān)鍵酶基因PMT1的表達(dá)下調(diào)。結(jié)合前人的研究，推測(cè)NtWRKY-R1抑制了JA信號(hào)途徑，而JA又通過(guò)調(diào)控PMT的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)而影響PMT基因的表達(dá)。說(shuō)明，JA與NtWRKY-R1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與PMT的表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系。這為我們進(jìn)一步研究NtWRKY-R1參與煙堿合成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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