邱家洋

(淮南市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽淮南232007)

葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲從宿主細(xì)胞逸出的觀測

邱家洋

(淮南市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽淮南232007)

目的檢測葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲從感染的宿主細(xì)胞逸出的效力。方法用不同濃度(20、50和100 μmol/L)的葫蘆素E孵育剛地弓形蟲感染的HFF細(xì)胞1 h，統(tǒng)計(jì)納蟲空泡破損比例;用細(xì)胞松弛素D、1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N＇，N＇-四乙酸四乙酰氧甲基酯(BAPTA-AM)預(yù)處理感染剛地弓形蟲的HFF細(xì)胞，用50 μmol/L葫蘆素E孵育1 h，統(tǒng)計(jì)納蟲空泡破損比例;將逸出蟲體重新感染細(xì)胞或腹腔注射昆明小鼠，檢測蟲體毒力變化。結(jié)果葫蘆素E可以誘導(dǎo)剛地弓形蟲從HFF細(xì)胞釋放逸出，葫蘆素E濃度越高，逸出率越高。葫蘆素E誘導(dǎo)的蟲體逸出與蟲體的運(yùn)動能力和蟲體內(nèi)鈣離子有關(guān)，逸出蟲體的毒力沒有發(fā)生明顯變化。結(jié)論葫蘆素E可以誘導(dǎo)剛地弓形蟲的逸出，為探索弓形蟲和宿主細(xì)胞相互作用提供了新的研究方向。

葫蘆素E;剛地弓形蟲;逸出

剛地弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染所有有核細(xì)胞，引發(fā)弓形蟲病。全球約有30%的人口發(fā)生弓形蟲慢性感染。剛地弓形蟲完成在宿主細(xì)胞內(nèi)感染過程需經(jīng)過入侵、胞內(nèi)復(fù)制和逸出3個階段。弓形蟲對宿主造成的損傷主要是逸出階段。因此闡明弓形蟲的逸出機(jī)制可更好地解析弓形蟲的致病機(jī)理。前期研究表明，鈣離子載體和二硫蘇糖醇均可誘導(dǎo)弓形蟲逸出，這個過程依賴于蟲體的運(yùn)動能力［1］。同時(shí)，宿主免疫相關(guān)因素，如γ-干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)［2］、一氧化氮(nitric oxide，NO)［3］、穿孔素、死亡受體偶聯(lián)也可誘導(dǎo)弓形蟲逸出［4］。最近的一些研究表明，弓形蟲感染引起的腫瘤部位微環(huán)境的改變可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的消除，如弓形蟲感染可以使腫瘤周圍的巨噬細(xì)胞從M2型轉(zhuǎn)化為M1型，機(jī)體內(nèi)部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量降低，進(jìn)而產(chǎn)生大量抗腫瘤CD8+T細(xì)胞，而且自然殺傷細(xì)胞也會向腫瘤部位聚集［5-7］。但是，腫瘤患者會使用一些化學(xué)藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤的生長，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤的目的。先前研究表明，抗腫瘤藥物紫杉醇可抑制弓形蟲的細(xì)胞增殖［8］，但抗腫瘤藥物能否影響弓形蟲的逸出仍不清楚。為此，我們研究了抗腫瘤藥物葫蘆素E對剛地弓形蟲逸出的影響。

材料和方法

一、蟲株和實(shí)驗(yàn)動物

胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)黃色熒光蛋白的蟲株由美國賓夕法尼亞大學(xué)David Roos實(shí)驗(yàn)室惠贈，并在HFF細(xì)胞中連續(xù)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)所用血清和DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自于HyClone公司。6～8周齡昆明鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。葫蘆素E購自上海展舒化學(xué)科技有限公司。HFF細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞松弛素D和1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N＇，N＇-四乙酸四乙酰氧甲基酯［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N＇，N＇-tetraacetic acid tetrakis acetoxymethyl ester，BAPTAAM］均購自于西格瑪奧德里奇公司。

二、葫蘆素E誘導(dǎo)逸出的檢測

將HFF細(xì)胞培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。當(dāng)細(xì)胞融合率約為80%時(shí)按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=1的比率用剛地弓形蟲感染細(xì)胞，記為感染0 h。36 h后，用不同濃度(20、50和100 μmol/L)的葫蘆素E孵育感染細(xì)胞1 h，隨機(jī)選取5個視野，統(tǒng)計(jì)納蟲空泡的破損率［1］，以未用葫蘆素E處理的HFF細(xì)胞作為對照組。為研究逸出和蟲體運(yùn)動、鈣離子關(guān)系，剛地弓形蟲感染HFF細(xì)胞36 h后分別用50 μmol/L BAPTA-AM、1 μmol/L細(xì)胞松弛素D預(yù)處理細(xì)胞10 min，然后用50 μmol/L葫蘆素E孵育1 h，在OLYMPUS IX71熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)逸出率［4］。

三、逸出蟲體毒力檢測

將含有逸出蟲體的細(xì)胞培養(yǎng)液收集，750×g離心10 min，重新懸浮計(jì)數(shù)后，按MOI=1的感染率感染HFF細(xì)胞，24 h后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，對納蟲空泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算含有2、4、8和16個速殖子納蟲空泡的比率。在小鼠感染試驗(yàn)中，按1 000個速殖子/只小鼠的感染量經(jīng)腹腔感染10只6～8周齡昆明鼠，觀察記錄小鼠死亡情況，計(jì)算存活率［9］。以自然逸出(約感染后72 h)剛地弓形蟲作為對照組。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲從HFF細(xì)胞中逸出的觀察

葫蘆素E處理后HFF細(xì)胞存在蟲體逸出現(xiàn)象，且與葫蘆素E濃度有關(guān)。20、50和100 μmol/L葫蘆素E處理后的逸出率分別為16.20%±4.75%、46.50%±7.53%、76.20%±9.42%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 葫蘆素E誘導(dǎo)弓形蟲逸出的觀察

二、葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲逸出與蟲體運(yùn)動能力的關(guān)系

細(xì)胞松弛素D預(yù)處理組和BAPTA-AM預(yù)處理組的逸出率略高于空白對照組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05);但與50 μmol/L葫蘆素E單獨(dú)處理組相比，細(xì)胞松弛素D預(yù)處理組和BAPTA-AM預(yù)處理組的逸出率明顯降低(P均＜0.05)。細(xì)胞松弛素D預(yù)處理組和BAPTA-AM預(yù)處理組之間逸出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

三、逸出蟲體的毒力變化

逸出蟲體在感染HFF細(xì)胞24 h后處于8速殖子納蟲空泡狀態(tài)的比例為35.80%±9.37%，與對照組(40.00%±9.70%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對照組小鼠的平均存活時(shí)間為4.5 d，逸出蟲體組小鼠平均存活時(shí)間為5.0 d，2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

圖2 葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲逸出與藥物濃度、蟲體運(yùn)動、蟲體鈣離子的關(guān)系

圖3 自然逸出和葫蘆素E誘導(dǎo)逸出的剛地弓形蟲在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和毒力水平的比較

討論

弓形蟲感染可引起腫瘤部位免疫微環(huán)境的變化，提示弓形蟲，尤其是弱毒蟲株具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)物的作用［5-7］。研究表明，抗腫瘤藥物紫杉醇可抑制剛地弓形蟲在宿主細(xì)胞的分裂增殖［8］。本研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物葫蘆素E可誘導(dǎo)剛地弓形蟲逸出，并且逸出率依賴于藥物劑量、蟲體內(nèi)鈣離子和蟲體運(yùn)動能力。逸出蟲體的胞內(nèi)復(fù)制和毒力水平均無明顯變化。

研究表明穿孔素孵育、死亡受體偶聯(lián)誘導(dǎo)的蟲體逸出以及乙醇誘導(dǎo)的蟲體逸出與蟲體內(nèi)的鈣離子有關(guān)［4］。IFN-γ誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)弓形蟲的逸出可能是由于納蟲空泡表面附著的宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子流動到納蟲空泡后引起蟲體運(yùn)動增強(qiáng)而引發(fā)的［2］。本研究結(jié)果表明葫蘆素E誘導(dǎo)的蟲體逸出和蟲體內(nèi)的鈣離子有關(guān)。用BAPTAAM螯合蟲體內(nèi)的鈣離子后葫蘆素E誘導(dǎo)蟲體逸出比例明顯下降［見圖2(b)］。鈣離子主要通過調(diào)控弓形蟲鈣依賴性蛋白激酶1(Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase1，TgCDPK1)蛋白活性［10］，促進(jìn)微線蛋白［如弓形蟲穿孔素樣蛋白1(Toxoplasma gondii porforin-like protein 1，TgPLP1)］的釋放，進(jìn)而引發(fā)納蟲空泡膜通透性增加，最終導(dǎo)致蟲體主動逸出［11］。葫蘆素E誘導(dǎo)的蟲體逸出可能也是通過調(diào)節(jié)TgCDPK1蛋白活性，引發(fā)TgPLP1釋放實(shí)現(xiàn)的。其中的蟲體內(nèi)源性鈣離子調(diào)節(jié)通路可能是由脫落酸介導(dǎo)［12］，但這仍需要后續(xù)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

研究表明，鈣離子載體A23187或IFN-γ誘導(dǎo)逸出的蟲體可能在入侵周圍細(xì)胞的能力上有所下降，說明這種提前逸出是宿主清除胞內(nèi)病原的一種新模式［13-14］。雖然本研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素E誘導(dǎo)逸出的蟲體在毒力上沒有發(fā)生明顯變化，但這些逸出的蟲體若被活化免疫細(xì)胞捕獲就會被殺滅，提示抗腫瘤藥物具有抗弓形蟲的潛在應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤候選藥物葫蘆素E具有誘導(dǎo)剛地弓形蟲逸出的效果，但葫蘆素E誘導(dǎo)剛地弓形蟲逸出的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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Observation of cucurbitacin E-induced egress of Toxop lasma gondii from host cells

QIU Jiayang.(Department of Clinical Laboratory，the First People's Hospital of Huainan，Anhui Huainan 232007，China)

ObjectiveTo investigate the effect of cucurbitacin E on the egress of Toxoplasma gondii from host cells.MethodsToxoplasma gondii infected HFF cells were treated with cucurbitacin E(20，50 and 100 μmol/L)for 1 h，and the egress rate was evaluated statistically.Toxoplasma gondii infected HFF cells were pretreated with Cyto-D and 1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N＇，N＇-tetraacetic acid tetrakis acetoxymethyl ester(BAPTA-AM)，followed by 50 μmol/L cucurbitacin E treatment for 1 h and egress determination.The virulence change of egressing Toxoplasma gondii，such parasites were collected and used to re-infect HFF or infect Kunming mice，was analyzed.ResultsCucurbitacin E could induce the egress of Toxoplasma gondii from host cells，and the egress rate increased with the concentration of cucurbitaci E.Cucurbitacin E-induced ergess depended on the gliding ability of Toxoplasma gondii and intra-parasite calcium.There was no difference between cucurbitacin E-induced egressing parasite and naturally egressing parasite in virulence.ConclusionsCucurbitacin E could induce the egress of Toxoplasma gondii from host cells，which provides new direction to study the interactions between Toxoplasma gondii and its host cells.

Cucurbitacin E;Toxoplasma gondii;Egress

1673-8640(2015)09-0944-04

R979.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.018

2015-07-09

(本文編輯:龔曉霖)

邱家洋，男，1969年生，學(xué)士，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作和病原微生物學(xué)研究。