張穎+李冰+朱健+蔣高中

摘要：采用同源克隆和末端快速擴(kuò)增（rapidamplicationofcDNAends，RACE）方法分離克隆了異育銀鯽（Allogyogeneticscruciancarp）中科3號肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因全長DNA，得到3394bp全長的DNA，包含3段外顯子和2段內(nèi)含子，其中2098bp的全長cDNA在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對后，確定為異育銀鯽中科3號MSTN基因。對推測的MSTN基因氨基酸序列進(jìn)行同源性比對和系統(tǒng)分析顯示：MSTN基因在異育銀鯽與斑馬魚及其他魚類間的氨基酸序列相似度為73.5%～98.0%，與鯉魚MSTN基因相似度最高（98.0%），不同物種間MSTN的氨基酸序列較為保守。用半定量RT-PCR檢測MSTN基因在異育銀鯽心、腸、肌、腦、鰓和肝的相對表達(dá)量結(jié)果表明，MSTN基因在腦中含量最高，其次是肌、鰓、心、腸，在肝臟中含量最低。

關(guān)鍵詞：異育銀鯽；肌肉生長抑制素；同源法克??；末端快速擴(kuò)增法；序列分析；組織表達(dá)分析

中圖分類號：S917.4；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0040-05

鯽魚是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類，異育銀鯽（Allogyogeneticscruciancarp）中科3號是當(dāng)前主要的鯽魚養(yǎng)殖品種之一。該品種是中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室桂建芳研究員等技術(shù)人員利用銀鯽的雙重生殖方式，從高體型（D系）異育銀鯽（♀）與平背型（A系）異育銀鯽（♂）交配所產(chǎn)后代中選育出來，再經(jīng)異精雌核培育而來的異育銀鯽第3代新品種[1]。中科3號異育銀鯽具有生長速度快、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點[2-4]，作為經(jīng)濟(jì)魚類，其肌肉的生長發(fā)育是重要的生長過程，受分子水平調(diào)控等多因素的影響[5]。

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）又稱生長分化因子-8（growthdifferentiationfactor-8，GDF-8），屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transfominggrowthfactor-β，TGF-β）超家族，是肌肉發(fā)育和生長的負(fù)調(diào)控因子[6]。該基因是McPherron等于1997年在小鼠骨骼肌的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的，試驗表明，MSTN基因敲除后的小鼠會發(fā)生肌細(xì)胞的增生與肥大，從而導(dǎo)致骨骼肌大量增加的現(xiàn)象[6]；牛中MSTN基因的自然缺失與突變也已被發(fā)現(xiàn)，突變結(jié)果導(dǎo)致MSTN基因失活，肌肉增生[7-8]。

目前，已有不少關(guān)于MSTN基因克隆及作用機(jī)制的研究，包括哺乳類[9-11]、鳥類[12-14]動物，在魚類的研究中，也有不少物種的MSTN基因被報道，包括斑馬魚（Daniorerio）[8，15]、虹鱒（Oncorhychusmykiss）[16]、大麻哈魚（Salmosalar）[17]、莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）[18]、斑點叉尾（Ictaluruspunctatus）[19]、石首魚（Umbrinacirrosa）[20]、奧利亞羅非魚（Oreochromisaureus）[21]、鳡魚（Elopichthysbambusa）[22]、軍曹魚（Rachycentroncanadum）[23]、牙鲆（Paralichthysolivaceus）[24]、勒氏笛鯛（Lutjanusrussellii）[25]、黃顙魚（Pelteobagrusefulvidraco）[26]、泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）[27]、真鯛（Chrysophrysmajor）[28]、鳙魚（Aristichthysnobilis）[29]等。魚類MSTN基因除在骨骼肌中表達(dá)外，還可在其他組織如腦、心臟、腎、腸、精巢、鰓、脾、眼、肝等中表達(dá)[22，30]，不同于哺乳動物和鳥類的表達(dá)譜[31-32]。試驗表明，MSTN基因功能缺失可以導(dǎo)致斑馬魚肌肉數(shù)量和體積的增加[15]。MSTN通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌3種不同的作用途徑發(fā)揮作用，可與成肌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而引起受體自身的磷酸化，啟動一系列信號傳導(dǎo)過程，最終抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化[33]。MSTN作為肌肉生長發(fā)育相關(guān)的重要調(diào)控基因，其相關(guān)研究對了解魚類肌肉生長機(jī)理有重要作用。本試驗克隆了異育銀鯽MSTN基因，并對其序列和組織表達(dá)進(jìn)行了分析。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用異育銀鯽中科3號質(zhì)量約80g，購自揚州市江都區(qū)，取20尾于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心（江蘇無錫）的育種實驗室進(jìn)行暫養(yǎng)，用于RNA及DNA的提取?；蛱崛?、反轉(zhuǎn)錄等試劑盒均購自TaKaRa公司（大連）。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA、基因組DNA的提取和cDNA模板的制備取試驗魚骨骼肌、腦、肝等6個組織，按RNAisoplus試劑盒的方法提取總RNA，使用基因組DNA提取試劑盒從全血中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖電泳和分光光度計檢測所提基因的質(zhì)量和濃度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)后置于-20℃保存。

1.2.2MSTN基因克隆與序列分析根據(jù)鯉魚（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）和斑馬魚（Daniorerio，AY323521.1）的MSTN基因設(shè)計3對引物MSTNF1、MSTNR1，MSTNF2、MSTNR2，MSTNF3、MSTNR3（表1），用于擴(kuò)增MSTNcDNA核心片段。根據(jù)所得序列設(shè)計用于5′RACE和3′RACE的特異性引物：MSTN5outer、MSTN5inner，MSTN3outer、MSTN3inner（表1），分別按照5′RACE和3′RACE試劑盒進(jìn)行2輪擴(kuò)增的巢式PCR。由鯉魚（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）MSTN基因全序列設(shè)計2對引物MSTNF4、MSTNR4，MSTNF5、MSTNR5（表1）擴(kuò)增2個內(nèi)含子。擴(kuò)增產(chǎn)物均在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，膠回收后經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)大培養(yǎng)、酶切驗證后，將陽性克隆送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。將所測序列登錄NCBI進(jìn)行BLAST分析；用DNAstar軟件分析序列及開放閱讀框，并對其分子量、等電點、氨基酸組成等進(jìn)行分析；用MEGA5.0軟件中的距離矩陣鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3半定量RT-PCR檢測取試驗魚骨骼肌、腦、肝、腸、心、鰓6個組織，提取總RNA，平衡起始濃度后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)拼接獲得的MSTN全長cDNA序列，設(shè)計半定量RT-PCR引物MSTNF6、MSTNR6（表1）和內(nèi)參β-actin（GenBank：AB039726.2）基因引物βF、βR[34]（表1），以各組織的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用以上2對引物進(jìn)行擴(kuò)增。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1試驗結(jié)果

將PCR產(chǎn)物測序后進(jìn)行比對，得到了異育銀鯽MSTN基因的完整DNA序列，包括416、360、454bp3段部分編碼序列，5′和3′兩端324、990bp序列，以及756、776bp2段內(nèi)含子序列。經(jīng)NCBI的BLAST序列比對，確認(rèn)所得序列為鯽魚的MSTN序列。

2.2結(jié)果分析

2.2.1MSTN基因序列、氨基酸組成及特征位點分析以異育銀鯽骨骼肌cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、膠回收、克隆和測序，去除載體序列和重疊序列，拼接得到2098bp的全長cDNA，其中5′端擴(kuò)增得到268bp，5′UTR為89bp；3′端擴(kuò)增得到934bp，3′UTR為881bp，詳見圖1，可以看出，該cDNA包括典型的轉(zhuǎn)錄終止信號序列（AATAAA）和polyA尾。用DNASTAR軟件預(yù)測可知，MSTN的分子量約為42.25ku，開放閱讀框為1128bp，編碼375個氨基酸，其中包含強堿性氨基酸（K、R）43個，強酸性氨基酸（D、E）47個，疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）116個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）105個，等電點為6.55。BLASTP分析發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽MSTN蛋白有2個典型的TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域（圖1），1個是TGF-β前肽結(jié)構(gòu)域，從第37位到第256位，共220個氨基酸殘基；另1個是TGF-β功能域，是TGF-β家族基因的活性區(qū)域，從第281位到第375位，共94個氨基酸殘基。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，N末端含有1個22個氨基酸組成的信號肽序列，切割位點位于22位的G和23位的D之間；碳端生物活性區(qū)含有9個保守的半胱氨酸殘基；異育銀鯽MSTN蛋白也有典型的RXXR蛋白酶水解位點，為RARR（第263-266位）；起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖1）?？傮w看出，異育銀鯽與其他物種的MSTN基因特征相同[22-24]。

2.2.2異育銀鯽MSTN序列同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析將異育銀鯽MSTN與其他動物MSTN的ORF序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見表2。

用DNAMANVersion6.0軟件，比較異育銀鯽與人、小鼠、原雞、斑點叉尾、斑馬魚、大馬哈魚、大西洋鮭、虹鱒、鰱魚、鯉和牙鲆的MSTN氨基酸同源性。結(jié)果顯示，異育銀鯽與上述物種的序列同源性分別為75.0%、73.5%、75.0%、88.1%、89.9%、91.3%、75.4%、76.9%、97.0%、98.0%、79.8%，異育銀鯽MSTN與鯉魚MSTN的遺傳距離最小，僅為0.020。

基于異育銀鯽MSTN氨基酸序列和公布的其他物種的相應(yīng)序列，用MEGA5.0構(gòu)建了脊椎動物MSTN的分子進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，整個進(jìn)化樹分為2大分支，其中1支由人、哺乳類和禽類組成，另1支由魚類組成；異育銀鯽與鯉關(guān)系最近，與鯉魚、斑馬魚、鰱魚、斑點叉尾4種鯉形目魚類在1個分支里。由進(jìn)化樹分析可知，所克隆到的MSTN基因?qū)儆冖裥?，物種MSTN系統(tǒng)發(fā)育與物種間的親緣關(guān)系一致。

2.2.3異育銀鯽MSTN基因組織表達(dá)分析采用半定量RT-PCR方法檢測了MSTN基因mRNA在異育銀鯽鰓、心、腸、肝、腦、肌肉6個組織中的表達(dá)情況，圖3顯示，異育銀鯽不同組織均有1條70bp大小相同的條帶，條帶亮度具有組織差異性，在腦中表達(dá)量最高，在肌肉和鰓中表達(dá)量次之。以β-肌動蛋白基因為對照，進(jìn)行了以上組織的RT-PCR檢測，在所檢測的組織樣品中均得到β-肌動蛋白基因的特意擴(kuò)增條帶，說明不同組織中RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄過程正常，模板cDNA完整，推測不同組織中檢測到的MSTN轉(zhuǎn)錄子存在的差異是各組織MSTN表達(dá)情況的自然表現(xiàn)。

3討論與結(jié)論

本研究采用分子克隆技術(shù)得到了異育銀鯽中科3號MSTN基因的基因組DNA序列全長，并通過半定量RT-PCR方法檢測了MSTN基因mRNA在異育銀鯽鰓、心、腸、肝、腦、肌肉6個組織中的表達(dá)情況。MSTN作為胞外信號分子，可與成肌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而引起受體自身的磷酸化，從而啟動細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)過程，作用于生肌決定因子（MyoD）靶基因的調(diào)控區(qū)，調(diào)節(jié)肌肉組成蛋白和蛋白基因的表達(dá)。MSTN的生物學(xué)功能主要為抑制成肌細(xì)胞增殖和分化，其中抑制增殖是通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程來實現(xiàn)的，MSTN通過抑制生肌決定因子（MyoD、Myf5、MyoG）和P21的表達(dá)來可逆地抑制成肌細(xì)胞的分化。MSTN的信號傳導(dǎo)途徑是MSTN-ActRⅡB型受體（蛋白激酶受體）-Smad蛋白信號傳導(dǎo)通路，并通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌3種不同的途徑發(fā)揮作用[33]。

根據(jù)ClustalX2.0.11軟件對于異育銀鯽MSTN氨基酸序列進(jìn)行的同源性比較結(jié)果以及利用MEGA5.0軟件的NJ方法構(gòu)建的分子進(jìn)化樹表明，異育銀鯽MSTN氨基酸序列與其他物種的相似度在73.5%～98.0%之間，符合魚類的分類地位和親緣關(guān)系，異育銀鯽MSTN基因的氨基酸與鯉魚的氨基酸相似度最高，其次是斑馬魚和鰱魚，它們同屬于鯉形目鯉科，親緣關(guān)系最近；大馬哈魚、虹鱒和大西洋鮭隸屬于鮭形目，因此與異育銀鯽的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；原雞屬于鳥類，小鼠和人屬于哺乳綱，因此親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。研究發(fā)現(xiàn)MSTN基因在魚類中存在2個異構(gòu)體；在斑馬魚、大西洋鮭、大馬哈魚、虹鱒和鯉魚中都發(fā)現(xiàn)了2種MSTN，根據(jù)與其他物種的MSTN基因序列及氨基酸序列比較分析，本研究得到的異育銀鯽MSTN基因與其他物種的MSTN-1同源性較高，推測所克隆的為異育銀鯽MSTN-1基因，是否存在MSTN-2則需進(jìn)一步探究。

采用半定量RT-PCR技術(shù)對異育銀鯽鰓、心、肝、腸、腦、肌6個組織中MSTN的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果在上述6個組織均有表達(dá)，根據(jù)條帶的明暗程度推斷，MSTN在上述組織中的表達(dá)水平依次為腦>肌≈鰓>心>腸>肝，與其他物種MSTN表達(dá)譜不同。MSTN在哺乳動物中主要表達(dá)于骨骼肌中，小鼠MSTN基因只在骨骼肌中表達(dá)[6]；在豬中，MSTN基因除了在骨骼肌中表達(dá)外，在乳腺中也有表達(dá)[35]；有研究表明，MSTN基因還在藏系綿羊真胃、瘤胃中表達(dá)[36]。與哺乳動物相比，MSTN基因在魚類中的表達(dá)更廣泛，可以在腦、心、腸、鰓、腎、眼睛、脾、性腺等多個組織中表達(dá)，但在不同魚類中表達(dá)情況也不一樣。該基因在鳡的肌肉、腦和心臟中均有表達(dá)[22]；而在鯉魚中MSTN僅在肌肉和腦組織中檢測到，在其他組織如心臟、精巢、眼睛和鰓中均未檢測到[37]；在斑馬魚中，MSTN的表達(dá)譜也較廣，在肝、心、胃、鰓、卵巢、精巢、腎、肌肉、眼、腦中均有表達(dá)[38]；在黃河裸裂尻魚中，MSTN的表達(dá)在心臟、肝胰臟、腎、肌肉、腦、脂肪、腸、鰓和精巢共9個組織中均能檢測到[30]。由此可見，MSTN基因的表達(dá)情況在魚類中有較大差異，由MSTN在異育銀鯽中的表達(dá)特征和表達(dá)水平分析可知，異育銀鯽MSTN基因除調(diào)控肌肉生長發(fā)育外，還有可能參與心肌發(fā)育調(diào)控和代謝等其他功能。

MSTN是肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，異育銀鯽MSTN基因的克隆為進(jìn)一步研究異育銀鯽肌肉生長分化與調(diào)節(jié)及其他魚類該基因的克隆提供了依據(jù)，并為進(jìn)行分子育種和其他應(yīng)用創(chuàng)造了條件，人工控制MSTN的活性成為養(yǎng)殖業(yè)的一大課題。進(jìn)一步可以有以下研究方向：利用分子標(biāo)記技術(shù)選育肉質(zhì)性狀優(yōu)良的魚類；利用基因敲除技術(shù)獲得MSTN缺失魚類；利用RNAi技術(shù)干擾MSTNmRNA的表達(dá)篩選MSTN基因的抗體，開發(fā)飼料添加劑[38]。本試驗將繼續(xù)研究2代異育銀鯽MSTN基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）并進(jìn)行比較。在動物育種方面，SNPs作為一種分子標(biāo)記輔助育種強有力的工具也得到了廣泛的應(yīng)用，研究中會將SNPs與2個品種異育銀鯽體型及體質(zhì)量增長進(jìn)行相關(guān)性分析，以期為異育銀鯽分子標(biāo)記輔助育種提供一定依據(jù)，確定有效的育種方案，并運用到生產(chǎn)實踐中，為養(yǎng)殖品種的選擇提供一定的依據(jù)。

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