王艷龍，陳軍輝，李兆永，王 帥，鄭曉玲，王小如,2

(1.國家海洋局第一海洋研究所，海洋生態(tài)研究中心，山東 青島 266061；2.廈門華夏職業(yè)學(xué)院，福建 廈門 361024)

環(huán)亞胺類毒素(cyclic imines，CIs)是一類海洋脂溶性藻毒素，其特點(diǎn)是均含有環(huán)狀亞胺結(jié)構(gòu)，主要包括以下幾類化合物：Spirolides(SPXs)、Gymnodimines(GYMs)、Pinnatoxins(PnTxs)、Pteriatoxin(PtTxs)、Prorocentrolides和Spiro-prorocentrimine等[1]。環(huán)亞胺類毒素可使神經(jīng)產(chǎn)生急性中毒，最大的毒性特點(diǎn)是對(duì)動(dòng)物快速致死。雖然現(xiàn)在還沒有關(guān)于環(huán)亞胺類毒素造成人類中毒的報(bào)道，但是歐洲食品安全局已經(jīng)要求用更多的環(huán)亞胺類毒素?cái)?shù)據(jù)來評(píng)估其給貝類消費(fèi)者帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)[2]。GYMs和SPXs是最具代表性、也最為常見的環(huán)亞胺類毒素，近年來在世界不同地區(qū)的貝類、浮游生物以及海洋環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)[3-9]。由此可見，環(huán)亞胺類毒素對(duì)人類健康的潛在威脅不容忽視，研發(fā)環(huán)亞胺類毒素的有效檢測(cè)方法非常必要。

自20世紀(jì)90年代GYMs和SPXs被發(fā)現(xiàn)以來，根據(jù)它們快速致死的特征，小鼠生物活體測(cè)定方法[10]一直被用于該類毒素的檢測(cè)。為了解決小鼠生物活體測(cè)定法存在假陽性結(jié)果和無法準(zhǔn)確定量等問題，液相色譜法[11]、根據(jù)分子之間相互作用的受體檢測(cè)法[12-13]和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法[9,14]等開始逐漸用于典型環(huán)亞胺類毒素的檢測(cè)。質(zhì)譜作為檢測(cè)器，具有靈敏度高、選擇性好，以及可以提供待測(cè)物結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)點(diǎn)，在海洋藻毒素檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。然而，電噴霧質(zhì)譜法(ESI-MS)在測(cè)量基質(zhì)復(fù)雜的樣品時(shí)容易受到基質(zhì)的干擾[15]，造成測(cè)量結(jié)果偏差較大；而大氣壓化學(xué)電離(APCI)是另一種軟電離技術(shù)，與ESI-MS技術(shù)相比，其抗基質(zhì)干擾能力較強(qiáng)[16]，常用于ESI-MS檢測(cè)效果不佳的弱極性化合物的檢測(cè)。目前，采用大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(APCI-MS)對(duì)環(huán)亞胺類毒素進(jìn)行檢測(cè)的研究還未見報(bào)道。

本研究擬采用大氣壓化學(xué)電離-離子阱質(zhì)譜(APCI-IT-MS)技術(shù)對(duì)2種典型環(huán)亞胺類毒素(GYM和SPX1)的一級(jí)、多級(jí)質(zhì)譜特征進(jìn)行研究，與ESI-MS法進(jìn)行抗基質(zhì)干擾能力比較，并對(duì)液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法(LC-APCI-MS2)檢測(cè)GYM和SPX1的方法重復(fù)性、穩(wěn)定性等進(jìn)行考察，以期為L(zhǎng)C-APCI-MS2法測(cè)定環(huán)亞胺類毒素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

1200型高效液相色譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器等；6320型離子阱質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有ESI離子源和APCI離子源；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司產(chǎn)品；氮吹儀：安譜公司產(chǎn)品；Himac CR22GII高速冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司產(chǎn)品。

環(huán)亞胺類毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液GYM 和SPX1：加拿大國家海洋研究中心產(chǎn)品；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品；氨水(質(zhì)譜純)：瑞士Fluka公司產(chǎn)品；超純水：由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

沉積物樣品：于2012年5月28日采自杭州灣海域，保存于-20 ℃冰箱中；海水樣品：采自青島市近岸海域，保存于4 ℃冰箱中；赤潮藻樣品：本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的利瑪原甲藻；貝類樣品(紫貽貝)：購自青島水產(chǎn)品市場(chǎng)，購買后立即低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品各1瓶，用甲醇稀釋并定容至5 mL，得250.1 μg/L GYM和7 053 μg/L SPX1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(單標(biāo))；然后用甲醇稀釋成5.003 μg/L GYM和56.42 μg/L SPX1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于-20 ℃保存，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 ZORBAX Extend-C18色譜柱(3 mm×150 mm×3.5 μm)；流動(dòng)相：A為水，B為甲醇；洗脫梯度：0～5～22～27 min，20%B～64%B～100%B～20%B；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫：室溫(20～23 ℃)。

1.3.2APCI-MS條件 正離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 300，霧化氣壓力4.14×105Pa，干燥氣流速5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，氣化室溫度400 ℃，毛細(xì)管電壓4 kV，裂解電壓143.5 V，錐孔電壓40 V。進(jìn)行LC-APCI-MS2分析時(shí)，離子源各參數(shù)不變，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。GYM以m/z508 [M+H]+峰為母離子，m/z490的二級(jí)子離子[M-H2O+H]+峰為定量離子，碰撞能量為1 V；SPX1以m/z692 [M+H]+峰為母離子，m/z674的二級(jí)子離子[M-H2O+H]+峰為定量離子，碰撞能量為1 V。

1.3.3ESI-MS條件 正離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 300，霧化氣壓力2.76×105Pa，干燥氣流速11 L/min，干燥氣溫度350 ℃，毛細(xì)管電壓4 kV，裂解電壓143.5 V，錐孔電壓40 V。

1.4 基質(zhì)樣品溶液的制備

空白沉積物樣品提取液、空白海水樣品提取液、空白赤潮藻提取液和空白貝類組織提取液的制備方法參照文獻(xiàn)[17-20]。所有的樣品提取液經(jīng)0.22 μm尼龍纖維濾膜過濾至液相進(jìn)樣小瓶中，于-20 ℃條件下避光保存，待用。

取4份200 μL毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將按上述方法制備的4種不同類型的空白樣品基質(zhì)粗提液稀釋并定容至1 mL，配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。GYM、SPX1在不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度均為1.001 μg/L和11.28 μg/L。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1精密度 取GYM和SPX1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)條件重復(fù)測(cè)定6次，得到GYM和SPX1提取離子峰的峰面積和保留時(shí)間。計(jì)算GYM和SPX1峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，用于評(píng)價(jià)儀器的精密度。

1.5.2專屬性 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定甲醇(溶劑空白)、不同空白基質(zhì)樣品溶液和不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過對(duì)比空白基質(zhì)樣品溶液與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)該方法的專屬性。

1.5.3基質(zhì)效應(yīng) 為了評(píng)價(jià)4種不同類型樣品中基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物質(zhì)譜分析的影響，取按1.4節(jié)方法配制的4種不同類型樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過MS2分析，將測(cè)得的各目標(biāo)化合物峰面積與同一濃度水平甲醇配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作對(duì)比，來確定4種不同類型樣品中基質(zhì)對(duì)各目標(biāo)化合物的抑制作用。

1.5.4重復(fù)性和穩(wěn)定性 制備6個(gè)每種樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平行樣品，按1.3節(jié)條件進(jìn)行分析，得到各化合物提取離子峰的峰面積，根據(jù)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定該方法的重復(fù)性。測(cè)定后的樣品溶液置于4 ℃冰箱中保存，并分別在0、8、24、48、96 h后再進(jìn)樣測(cè)定，得到各化合物的峰面積，以各峰面積的RSD值作為樣品溶液穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 APCI質(zhì)譜分析特征

2.1.1APCI-MS分析特征 采用APCI正負(fù)切換全掃描模式對(duì)GYM和SPX1標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種典型環(huán)亞胺類毒素只在APCI+模式下有質(zhì)譜響應(yīng)，APCI-模式下并沒有質(zhì)譜信號(hào)。GYM和SPX1在APCI+模式下形成的準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰(基峰)分別為m/z508和m/z692，在一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)過程中未發(fā)現(xiàn)[M+Na]+和[M+NH4]+峰等，其一級(jí)質(zhì)譜圖示于圖1。GYM和SPX1在APCI+模式下與在ESI+模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖基本一致。文獻(xiàn)[21-22]采用ESI離子源進(jìn)行GYM和SPX1質(zhì)譜分析，在ESI+模式下，GYM和SPX1也均生成準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰(基峰)。

2.1.2APCI-MSn分析特征及裂解規(guī)律 在一級(jí)質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，分別以m/z508和m/z692離子峰作為母離子，對(duì)GYM和SPX1進(jìn)行APCI多級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果示于圖2和圖3。

圖1 GYM(a)和SPX1(b)大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 MS spectra of GYM (a) and SPX1 (b) by APCI-MS

圖2 GYM大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜的二級(jí)(a)和三級(jí)(b)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 (a) and MS3 (b) spectra of GYM by APCI-MS

圖3 SPX1大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜的二級(jí)(a)和三級(jí)(b)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2 (a) and MS3 (b) spectra of SPX1 by APCI-MS

GYM的APCI-MS2分析結(jié)果主要得到m/z490子離子峰(基峰)，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子m/z508失去一分子水([M+H-H2O]+)所形成，由于m/z490子離子峰的豐度高、穩(wěn)定性好，故在GYM分析中被選為定量離子。除m/z490外，還可以觀察到豐度很低的m/z410子離子峰，推測(cè)為母離子m/z508失去碎片-C5H6O2所形成。

選擇m/z490子離子峰進(jìn)行APCI-MS3分析，可以看出，m/z392子離子峰豐度最高，同時(shí)形成m/z472、462、446、378、162等碎片離子峰。推測(cè)m/z392離子為m/z490離子峰失去碎片-C5H6O2所形成，m/z378離子為m/z392繼續(xù)失去中性碎片-CH2所形成，m/z472離子為m/z490離子峰失去一分子水所形成，m/z462離子為m/z490離子峰失去碎片-CO所形成，m/z446離子為m/z490離子峰失去中性碎片-CO2所形成。m/z162離子應(yīng)為文獻(xiàn)[23-24]中指出的含有環(huán)亞胺結(jié)構(gòu)的碎片離子，其裂解途徑示于圖4a。

圖4 GYM(a)和SPX1(b)的裂解途徑Fig.4 Fragment pathways of GYM (a) and SPX1 (b)

從圖3可以看出，SPX1在APCI-MS2分析中主要得到一系列失水碎片離子，分別為m/z674([M+H-H2O]+)、m/z656([M+H-2H2O]+)和m/z638([M+H-3H2O]+)等。同時(shí)還形成了豐度較低的碎片離子m/z426，推測(cè)為準(zhǔn)分子離子m/z692丟失中性碎片-C15H22O3后再失去一分子水形成的，其裂解途徑示于圖4b。選取二級(jí)質(zhì)譜圖上豐度最大的m/z674離子作為三級(jí)質(zhì)譜分析的母離子，可以看出，裂解得到的仍是一系列失水碎片離子(m/z656、638和620)。

2.2 LC分離條件及APCI-MS靈敏度考察

乙腈-水和甲醇-水是環(huán)亞胺類毒素LC分離時(shí)常用的流動(dòng)相，本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水和甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，GYM和SPX1的色譜分離效果。結(jié)果表明，使用這兩種流動(dòng)相時(shí)，GYM和SPX1的分離效果相似，但為了降低APCI離子源電暈放電針上的積碳效應(yīng)，選擇了甲醇-水作為流動(dòng)相。在此基礎(chǔ)上，對(duì)LC-APCI-MS和LC-ESI-MS分析GYM和SPX1標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為1.001 μg/L和11.28 μg/L)的靈敏度進(jìn)行比較，結(jié)果示于圖5。兩種毒素在APCI條件下的EIC色譜峰信噪比(S/N)優(yōu)于ESI條件下的信噪比。由于信噪比的提高，使得兩種毒素在APCI條件下的檢出限(GYM和SPX1分別為1.00 pg和5.64 pg)比ESI條件下的檢出限(GYM和SPX1分別為5.00 pg和28.2 pg)降低了大約5倍。

2.3 LC-APCI-MS2方法學(xué)考察

2.3.1基質(zhì)效應(yīng) 在LC/MS2分析復(fù)雜基質(zhì)樣品的過程中，與分析物共流出的基體中內(nèi)生化合物對(duì)MS2檢測(cè)靈敏度有重要的影響[22]，在很大程度上，基質(zhì)效應(yīng)與提取物類型有關(guān)[25]。本研究選取4種不同類型樣品基質(zhì)，考察了LC-APCI-MS2方法檢測(cè)GYM和SPX1的抗基質(zhì)干擾能力，并與LC-ESI-MS2方法進(jìn)行比較，結(jié)果列于表1?？梢钥闯觯m然不同樣品基質(zhì)均能對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)影響，但APCI條件下產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)比ESI條件下產(chǎn)生的影響小，這更有利于目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確測(cè)定。本研究的目的是探明典型環(huán)亞胺類毒素APCI-MS的分析特征，因此，并沒有針對(duì)不同樣品基質(zhì)的特點(diǎn)優(yōu)化色譜分離條件。在將APCI-MS2應(yīng)用于實(shí)際樣品分析時(shí)，可在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化色譜分離條件，最大程度的降低樣品基質(zhì)影響，以獲得最佳的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。

注：a.GYM,ESI+;b.SPX1,ESI+;c.GYM,APCI+;d.SPX1,APCI+圖5 GYM和SPX1的LC-APCI/ESI-MS提取離子流圖Fig.5 EICs of GYM and SPX1 by LC-APCI/ESI-MS

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液化合物(定量離子，m/z)ESI抑制率/%APCI抑制率/%沉積物GYM(4901)-123-560SPX1(6744)-175-145海水GYM(4901)+117-111SPX1(6744)+113+050赤潮藻體GYM(4901)-815-472SPX1(6744)+152+810貝類組織GYM(4901)-302-134SPX1(6744)-171-920

注：+表示信號(hào)增強(qiáng)；-表示信號(hào)抑制

2.3.2專屬性 采用1.3節(jié)條件對(duì)試劑空白(甲醇)、不同樣品空白和不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明(以沉積物基質(zhì)為例)，在試劑空白和不同樣品空白中均未檢測(cè)出相應(yīng)的毒素，而在基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中檢測(cè)出了GYM和SPX1，結(jié)果示于圖6，說明本方法具有良好的專屬性。

2.3.3精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GYM和SPX1化合物的峰面積RSD不大于4.25%，保留時(shí)間RSD不大于0.24%，說明儀器具有較好的精密度。APCI條件下，4種不同基質(zhì)中兩種毒素的峰面積RSD均小于10.0%，表明該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，能滿足不同基質(zhì)樣品中SPX1和GYM藻毒素同步測(cè)定的要求，結(jié)果列于表2。

圖6 LC-APCI-MS2分析沉積物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的TIC(a)和EICs(GYM(b)和SPX1(c))圖 Fig.6 TIC (a) and EICs (GYM (b) and SPX1 (c)) of spiked marine sediment sample by LC-APCI-MS2

表2 LC-APCI-MS2分析重復(fù)性和穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of repeatability and stability by LC-APCI-MS2 (n=6)

3 結(jié)論

本研究解析了2種典型環(huán)亞胺類毒素(GYM和SPX1)在APCI條件下的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜特征以及多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)表明，APCI-MS法的靈敏度和抗基質(zhì)干擾能力均好于ESI-MS法，說明APCI-MS法更適于典型環(huán)亞胺類毒素的分析。此外，采用LC-APCI-MS2法分析沉積物、海水、赤潮藻以及生物體基質(zhì)樣品，均能獲得良好的方法專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，這為發(fā)展LC-APCI-MS2法定性、定量分析不同基質(zhì)復(fù)雜樣品中環(huán)亞胺類毒素打下了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。后續(xù)工作可在本研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)不同樣品的特點(diǎn)，采取合適的樣品前處理方法，以開發(fā)APCI-MS分析不同類型樣品中典型環(huán)亞胺類生物毒素的有效方法。

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