何 超， 索緒斌， 張 涵， 王偉明*

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150036；2.廣東藥學(xué)院，廣東廣州51006）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化鮮地龍可溶性蛋白提取工藝

何 超1， 索緒斌2， 張 涵1， 王偉明1*

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150036；2.廣東藥學(xué)院，廣東廣州51006）

目的優(yōu)化鮮地龍中可溶性蛋白的提取工藝。方法冰浴超聲提取法，采用響應(yīng)曲面Box-Benhnken設(shè)計(jì)，考察攪碎時(shí)間、料液比、提取液的pH對(duì)可溶性蛋白得率的影響，對(duì)鮮地龍可溶性蛋白冰浴超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果冰浴超聲提取鮮地龍蛋白的最佳工藝條件為加入2倍量pH 7.46的緩沖液后攪碎256 s，再加入4.63倍的緩沖液冰浴超聲15 min，此條件下蛋白質(zhì)得率為21.01%。結(jié)論冰浴超聲法簡(jiǎn)單、快速、高效，工藝穩(wěn)定可行，適用于鮮地龍可溶性蛋白提取。

響應(yīng)面法；鮮地龍；可溶性蛋白；冰浴超聲

地龍為環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.perrier）、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛肓毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥體。前1種俗稱(chēng) “廣地龍”，后3種俗稱(chēng) “滬地龍”［1］。地龍?jiān)谖覈?guó)藥用歷史悠久，《本草綱目》上就記載了地龍的作用?，F(xiàn)代中醫(yī)藥理論認(rèn)為地龍有清熱定驚，通絡(luò)，平喘，利尿的功效［2］。近代藥理研究表明地龍有抗凝血溶血的雙重作用、改善微循環(huán)和心腦血管病理狀態(tài)、調(diào)節(jié)肝臟功能等作用［3-4］。可溶性蛋白是地龍中的主要活性物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外研究表明其是地龍溶血栓、抗血栓的主要活性物質(zhì)［5-6］。

已有研究顯示鮮地龍中的蛋白種類(lèi)及含有量都比干地龍豐富［7］，而查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)地龍蛋白提取工藝的研究很少，且研究對(duì)象多為干地龍［8-9］。因而實(shí)驗(yàn)旨在于優(yōu)化對(duì)鮮地龍可溶性蛋白的提取工藝，對(duì)于地龍藥材的合理、有效利用具有重要意義。

1 材料、試劑和儀器

本實(shí)驗(yàn)所用鮮地龍均來(lái)自東莞郊區(qū)，從野外收集后在極近自然環(huán)境中養(yǎng)殖保存以備實(shí)驗(yàn)之用。

考馬斯亮藍(lán)G250（Ameresco-0615，Biosharp進(jìn)口分裝）；牛血清白蛋白 （上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；所用水均為純化水?/p>

SG280-B4榨汁/攪拌器 （中山市好媽咪電器廠(chǎng)）；TGL-16C高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；Sartorius BAS 124S型分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器 （北京）有限公司）；JJ500型電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠(chǎng)）；PHS-3C型pH計(jì) （上海雷磁）；KQ5200B超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；759型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （上海菁華科技儀器有限公司）等。

2 方法與結(jié)果

2.1 可溶性蛋白測(cè)定［9］以牛血清白蛋白為對(duì)照品，采用Brodford法測(cè)定提取液中可溶性蛋白的量，本實(shí)驗(yàn)中未特別說(shuō)明的蛋白含有量均以牛血清白蛋白計(jì)。

考馬斯亮藍(lán)G250溶液的配制：稱(chēng)取100 mg考馬斯亮蘭G250，用50 mL 95%的乙醇超聲分散后于50～60℃水浴中充分溶解2 h，再加入120 mL 85%的磷酸50～60℃水浴2 h，用去離子水定容至1 L，過(guò)濾，濾液置棕色瓶?jī)?nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密稱(chēng)取24.4 mg標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（BSA）以0.9%NaCl溶液溶解后定容于25 mL量瓶中，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.00、2.75、3.50、4.25、5.00 mL分別置于10 mL量瓶中，以0.9%NaCl溶液定容至刻度，得質(zhì)量濃度分別為 195.2、268.4、341.6、414.8、488.0μg/mL的BSA溶液。向5支5 mL具塞試管中依次加入0.10 mL上述BSA溶液，以0.9%NaCl溶液補(bǔ)至0.25 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液，充分搖勻后放置15 min，于595 nm處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量 （μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性方程為Y=0.005 9x+0.085 1，r2=0.998 6，在19.52～48.80μg范圍內(nèi)線(xiàn)性良好可用于定量測(cè)定。

2.1.2 精密度考察 精密吸取線(xiàn)性項(xiàng)下質(zhì)量濃度為341.6μg/mL的對(duì)照品溶液0.10 mL，按方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD為0.36%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性考察 精密吸取6份線(xiàn)性項(xiàng)下質(zhì)量濃度為341.6μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.10 mL，按方法測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中可溶性蛋白含量，RSD為2.07%。

2.1.4 加樣回收率 取已測(cè)定蛋白量的鮮地龍?zhí)崛∫?（含可溶性蛋白8.90 mg），分別加入BSA6.25、7.80、9.35 mg，每個(gè)樣品平行3份，以0.9%NaCl溶液稀釋至適宜濃度，依法測(cè)定吸光度，結(jié)果平均回收率為106.1%，RSD為2.1%。

2.1.5 穩(wěn)定性研究 取線(xiàn)性項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，依法測(cè)定加入考馬斯亮藍(lán)G250搖勻后15、20、30、40、50、60 min時(shí)的吸光度，計(jì)算RSD為1.7%，表明該法在顯色后15～60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，適于含量測(cè)定。

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 樣品溶液制備 鮮地龍洗凈沙土后以10%乙醇麻醉，洗至無(wú)醇味后解剖除去腹腔中的泥沙及雜物。用濾紙吸干其表面附著的水，精密稱(chēng)量后，加入2倍量緩沖液，攪碎，再加提取液至所需體積，冰浴超聲15min。10 000 r/min離心5min后取上清液，稀釋至適宜濃度即可。精密吸取0.10 m L樣品溶液，照 “2.1.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定樣品吸光度值，計(jì)算蛋白量。

2.2.2 樣品中蛋白測(cè)定 參照 《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅨH水分測(cè)定法測(cè)定鮮地龍含水量。依照公式 （1）計(jì)算可溶性蛋白提取率，式中r為鮮地龍的含水量。

2.3 鮮地龍可溶性蛋白提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素預(yù)試驗(yàn) 選擇冰浴超聲提取法，考察了攪碎時(shí)間、料液比、提取液的pH對(duì)可溶性蛋白得率的影響。

2.3.1.1 料液比考察 平行取多個(gè)樣品，依照樣品制備方法，分別加入2、4、6、8、10、12、14倍pH 7.4的提取液，攪碎30 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測(cè)可溶性蛋白的提取率。以蛋白得率為縱坐標(biāo)，提取溶劑倍數(shù)為橫坐標(biāo)，制作蛋白得率（%） -提取溶劑倍數(shù)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6倍量pH 7.4的提取液可得蛋白提取率最高，而后隨著提取液的增加，蛋白提取率反而降低。

2.3.1.2 提取溶劑的pH考察 平行取多個(gè)樣品，依照樣品制備方法，分別加入6倍量的pH分別為6.8、7.0、7.4、7.8和8.0的提取液，攪碎30 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測(cè)可溶性蛋白得率。以蛋白得率為縱坐標(biāo)，提取液pH為橫坐標(biāo)，制作蛋白得率 （%）-提取液pH曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在一定的pH范圍內(nèi)，提高提取液的pH可以提高蛋白提取率，但超過(guò)7.4后，再提高提取液的pH反而不利于可溶性蛋白的提取，因而提取液最適宜pH應(yīng)為7.4。

2.3.1.3 攪碎時(shí)間考察 平行取多個(gè)樣品，依照樣品制備方法，加入6倍量pH 7.4的提取液，分別攪碎 30、120、210、300、390 s，冰浴超聲15 min，離心后依法測(cè)可溶性蛋白的提取率。以提取率為縱坐標(biāo)，提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，制作蛋白得率（%） -攪碎時(shí)間 （s）曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，總體上隨著攪碎時(shí)間的增加，蛋白得率升高，但其在120～210 s處有一個(gè)平臺(tái)，說(shuō)明其中可能有上升再下降的趨勢(shì)，結(jié)合攪碎時(shí)的觀察，隨著攪碎時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品膠狀嚴(yán)重不利于離心，且設(shè)備發(fā)熱嚴(yán)重。

綜合各因素，最終選擇提取液倍數(shù)4～8，提取液pH 7.0～7.8，攪碎時(shí)間30～330 s進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝。

2.3.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化提取工藝 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)原理，考察攪碎時(shí)間、料液比、提取液的pH對(duì)可溶性蛋白得率的影響。采用Design-Expert7.1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)水平因素安排見(jiàn)表1，響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of RSM test

表2 鮮地龍可溶性蛋白提取工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Conditions and results for extraction optim ization

對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸擬合得到多元二次回歸方程模型：

R1=-994.458 69-0.168 78A+19.353 87B+ 260.749 38C-2.658 33×10-3AB+0.032 125AC-1.984 38BC-1.070 33×10-4A2-0.307 0B2-17.145 31C2；式中A為攪碎時(shí)間，B為提取溶劑倍數(shù)，C為提取溶劑的pH，R1為可溶性蛋白得率。

對(duì)該模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。由方差分析結(jié)果可知該模型 （P=0.00 04，P＜0.05）顯著，相關(guān)系數(shù)R2為0.961 6，模型調(diào)整系數(shù)Radj為0.912 2，失擬項(xiàng) （P=0.563 7，P＞0.05），表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合程度良好，能較好的反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可利用該模型對(duì)鮮地龍可溶性蛋白得率進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

對(duì)模型回歸方程的系數(shù)的顯著檢驗(yàn)分析可知，一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2均為顯著影響項(xiàng)，表明各因素對(duì)可溶性蛋白得率的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)可溶性蛋白得率影響的順序?yàn)閿囁闀r(shí)間＞提取溶劑倍數(shù)＞提取溶劑pH。

表3 方差分析Tab.3 ANOVA regression analysis

攪碎時(shí)間、提取溶劑倍數(shù)及提取溶劑pH3個(gè)因素間的交互作用對(duì)鮮地龍蛋白得率的影響如圖1～3所示。

分析圖1A～3A可知，當(dāng)攪碎時(shí)間 （A）、提取溶劑倍數(shù) （B）及提取溶劑pH（C）3個(gè)因素均取值較小時(shí)，響應(yīng)曲面較陡，說(shuō)明在各要素均處于較低水平時(shí)，各要素對(duì)蛋白得率R1的影響顯著；而B(niǎo)、C均處于較高水平時(shí)，R1的響應(yīng)面幾乎為平面，說(shuō)明，此時(shí)BC對(duì)R1的影響較小。

分析圖1B～3B可知，各要素的影響與響應(yīng)面分析結(jié)果一致；AC、BC等高線(xiàn)圖均呈明顯的橢圓形，說(shuō)明攪碎時(shí)間和提取溶劑pH及提取溶劑倍數(shù)和提取溶劑pH兩個(gè)因素之間的交互作用均顯著，與方差分析結(jié)果一致。

經(jīng)過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，鮮地龍可溶性蛋白提取的最佳工藝條件為：攪碎257 s，提取溶劑6.63倍，提取溶劑的pH為7.46，此時(shí)可溶性蛋白的理論得率為19.98%。

圖1 攪碎時(shí)間和提取溶劑倍數(shù)對(duì)蛋白得率影響的效應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.1 M ultip le effects of grinding time and extraction solven t on protein yield response surface map and contour plots

圖2 攪碎時(shí)間和提取溶劑pH對(duì)蛋白得率影響的效應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.2 Effects of grinding time and extraction solvent pH on protein yield response sur facemap and contour plots

圖3 提取溶劑倍數(shù)和提取溶劑pH對(duì)蛋白得率影響的效應(yīng)面圖及等高線(xiàn)圖Fig.3 Effects ofmu ltip le extraction solvent and pH on protein yield response surfacemap and contour m ap

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最優(yōu)提取工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果蛋白質(zhì)平均得率21.01%，RSD 1.34%，與理論值的相對(duì)誤差為5.11%，說(shuō)明該優(yōu)選工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

3 討論與結(jié)論

地龍中成分含有量最為豐富的物質(zhì)即為蛋白質(zhì)，近年來(lái)關(guān)于地龍藥效的研究也表明蛋白質(zhì)類(lèi)成分是其主要的活性成分［10-12］。對(duì)于地龍蛋白的獲取，以前多采用動(dòng)物組織中可溶性蛋白獲取的通用方法［13-14］，采用高速勻漿或者低溫冷浸，離心取上清液，無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)試劑沉淀，透析除鹽，冷凍干燥獲取粗蛋白。這些方法要么對(duì)設(shè)備要求高，要么有處理周期長(zhǎng)、處理量小的缺點(diǎn)。而煎煮或者回流等熱提方法本身容易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)在冰浴超聲提取方法優(yōu)化的同時(shí)，對(duì)地龍蛋白的低溫冷浸法進(jìn)行了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)低溫冷浸法不僅提取周期長(zhǎng)，而且蛋白得率不是很高，工藝重現(xiàn)的難度也較大。采用冰浴超聲提取方法，不僅簡(jiǎn)單可行，而且蛋白提取率高、提取周期短。優(yōu)化后的工藝粗蛋白得率可達(dá)21.01%，可以用于鮮地龍可溶性蛋白的提取。

本研究利用響應(yīng)曲面分析法對(duì)冰浴超聲法提取鮮地龍可溶性蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明此方法具有良好的應(yīng)用性和預(yù)測(cè)性，能提供較準(zhǔn)確的變量和誤差信息，為鮮地龍可溶性蛋白的進(jìn)一步研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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Extraction optim ization for fresh earthworm protein by response surface m ethodology

HE Chao1， SUO Xu-bin2， ZHANG Han1， WANGWei-ming1*

（1.Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences，Harbin 150036，China；2.Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 51006，China）

response surfacemethodology（RSM）；fresh earthworm；soluble protein；ice-bath ultrasound

R284.2

A

1001-1528（2015）04-0758-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.014

2014-08-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（80303288）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目院所創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（2013G1081）

何 超（1989—），女，碩士生，從事中藥研發(fā)。E-mail：hechao.1990@163.com

*通信作者：王偉明，女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥及保健品研發(fā)。E-mail：zyyiy@163.com