■郭志英 郭 俏 來航線 薛泉宏

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100）

我國為蘋果生產(chǎn)大國，年產(chǎn)量近2 000萬噸，蘋果汁加工中每年排出鮮蘋果渣100多萬噸。目前僅有少部分果渣被用于發(fā)酵飼料生產(chǎn)，其余部分直接烘干用作飼料原料。蘋果渣含水量約80%，其干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量僅3%～5%，直接作飼料營養(yǎng)價值較低。但蘋果渣中含有少量可溶糖、維生素及礦質(zhì)元素，大量果膠質(zhì)、纖維素及半纖維素等高分子碳水化合物等營養(yǎng)成分[1]，是微生物的良好營養(yǎng)基質(zhì)。采用特定工藝通過微生物發(fā)酵可提高蘋果渣中蛋白質(zhì)含量，將蘋果渣轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)飼料，對緩解我國飼料蛋白資源缺乏，促進畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。近年已有較多以蘋果渣為原料生產(chǎn)蛋白飼料的發(fā)酵工藝研究[2-7]，其目的是提高發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量，而其中對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)的關(guān)注不多。酵母菌體及其代謝產(chǎn)物具有多種促生抗病功能[8-9]，因此發(fā)酵飼料中的酵母菌活菌數(shù)量也是影響發(fā)酵飼料營養(yǎng)品質(zhì)的重要因素之一，目前對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)量的研究不多。本文重點研究原料及發(fā)酵劑菌種組成對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量的影響，旨在為蘋果渣發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝優(yōu)化及發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：蘋果渣，由乾縣海升果汁廠提供。豆粕，市場購買。

菌種：黑曲霉UA8（Aspergillas niger）、產(chǎn)朊假絲酵母C1314（Candida utilis，縮寫為Cu）由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。

菌種活化培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基[10]。

1.2 方法

UA8孢子懸液制備：將活化好的UA8斜面管制成菌懸液，接入裝有50 ml PDA固體培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)3 d，向三角瓶中加100 ml無菌水（含0.5 g/l吐溫與石英砂）用無菌刮鏟刮取孢子，搖勻，血球板測得懸液的孢子數(shù)為3.7×108個/ml。

酵母菌Cu菌懸液制備：將活化好的Cu斜面管中加入少量無菌水制得菌懸液，轉(zhuǎn)移到100 ml無菌水瓶中（含0.5 g/l的吐溫與石英砂），搖勻，血球板測得菌菌懸液活菌數(shù)為3.9×108個/ml。

方案與操作：試驗設(shè)A、B兩個方案，以探索不同處理對發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量及酵母菌數(shù)的影響。

A.原料影響：設(shè)3種發(fā)酵原料：蘋果渣；蘋果渣∶油渣為7∶3；蘋果渣∶豆粕為7∶3。方法：向組培瓶中分別加入上述原料各15.00 g，4 g/l硫酸銨溶液40 ml，4層紗布包扎后，121℃滅菌40 min，冷卻后接入菌懸液：單菌發(fā)酵接入5 ml Cu菌懸液或UA8孢子懸液，混菌發(fā)酵接入2.5 ml Cu菌懸液和2.5 ml UA8孢子懸液，用無菌竹簽充分?jǐn)噭?，包扎?8℃培養(yǎng)3 d，稀釋平皿涂抹法測定發(fā)酵產(chǎn)物的酵母菌活菌數(shù)；同時用烘干法測定，40℃鼓風(fēng)干燥后測定發(fā)酵產(chǎn)物含水量和純蛋白質(zhì)含量，酵母菌數(shù)測定結(jié)果及純蛋白質(zhì)含量均用干基表示。

B.混合發(fā)酵劑組成比例影響：設(shè)4種發(fā)酵劑組成，4種原料比例。發(fā)酵劑∶酵母菌∶黑曲霉為分別為0∶0；1∶1；10∶1；100∶1。原料：蘋果渣∶油渣組成比例分別為10∶0；7∶3；8∶2；9∶1。方法：向組培瓶中分別加入上述干原料各15.00 g，4 g/l硫酸銨溶液40 ml，滅菌冷卻后接入混合菌懸液5 ml（按不同比例先制得混合菌懸液），具體方法同方案A。上述所有處理均重復(fù)3次，測定結(jié)果用平均值表示。

發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量測定：將烘干樣品粉碎，過篩，稱取0.300 0 g于小三角瓶中，加蒸餾水10 ml，在電爐上加熱至微沸，維持15 min，加飽和的氯化鈣1 ml，200 g/l磷酸氫二鉀1 ml，待出現(xiàn)白色絮凝物后，充分搖勻過濾，再用10 ml蒸餾水洗滌濾紙上的樣品，直至洗出液無銨離子(用鈉氏試劑檢驗)，將濾紙連同濾物放入消煮管中，100℃烘干后各加入8 ml濃硫酸，以小漏斗蓋住消煮管口，120℃碳化12 h后，用濃硫酸-過氧化氫法消煮完成后，選擇適宜的稀釋度用靛酚藍比色法[11]測定氮的含量，乘以系數(shù)6.25換算成蛋白質(zhì)含量。

發(fā)酵產(chǎn)物含水量測定：采用烘干稱重法測定。

發(fā)酵產(chǎn)物活菌數(shù)測定：采用稀釋平板涂抹法測數(shù)[10]。

結(jié)果計算：接入發(fā)酵劑處理較對照CK純蛋白質(zhì)增率用⊿ck表示；加入輔料（油渣或豆粕）處理較純蘋果渣對照純蛋白質(zhì)增率用⊿ap表示，分別用公式（1）、（2）計算。

⊿ck(%)=（接菌純蛋白質(zhì)含量-不接菌CK純蛋白質(zhì)含量）/接菌純蛋白質(zhì)含量×100 (1)

⊿ap(%)=（加輔料處理純蛋白質(zhì)含量-純蘋果渣純蛋白質(zhì)含量）/接菌純蛋白質(zhì)含量×100 (2)

2 結(jié)果與分析

2.1 原料組成及發(fā)酵劑對發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量的影響（見表1）

2.1.1 原料組成

從表1看出，不同原料組成發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)不同?；旖覥u+UA8處理中，不同原料組成發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)（108CFU/g）按蘋果渣+油渣（188.1）＞蘋果渣+豆粕（145.0）＞蘋果渣（11.8）排列。由此可知，原料組成為蘋果渣+油渣時，發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)為純蘋果渣的16倍。

表1 原料及發(fā)酵劑組成對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)與純蛋白質(zhì)含量的影響

從表1還可看出，不同原料組成發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量不同。混接Cu+UA8處理中，不同原料組成發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量（g/kg）排序為：蘋果渣+油渣（345.8）＞蘋果渣+豆粕（271.7）＞蘋果渣（246.9），蘋果渣+油渣、蘋果渣+豆粕處理的純蛋白含量分別較蘋果渣對照提高40.1%、10.0%；單接Cu與UA8時，純蛋白質(zhì)含量分別較蘋果渣對照提高46.8%、20.4%與31.9%、6.3%，即加入輔料油渣處理的純蛋白質(zhì)增率大于加入輔料豆粕。

2.1.2 發(fā)酵劑

從表1看出，不同發(fā)酵劑處理發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)不同。原料組成為蘋果渣+油渣時，Cu+UA8混菌接種處理發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)為188.1×108個/g，而單接Cu處理中酵母菌僅為3.6×108個/g，混接處理酵母菌數(shù)為單接的52倍；在蘋果渣+豆粕處理中，Cu+UA8混菌接種處理發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)為單接Cu處理的121倍。在純蘋果渣中亦有類似趨勢。即混菌發(fā)酵劑處理發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母菌活菌數(shù)遠高于酵母菌單獨接種。

從表1看出，不同發(fā)酵劑接種處理發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)含量不同。原料組成為蘋果渣+油渣時，發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量（g/kg）按混接Cu+UA8（345.8）＞單接UA8（320.3）＞單接Cu（312.5）排列；其它兩種原料組成蛋白質(zhì)含量排序與之類似。由此可知，混接Cu+UA8處理發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)含量較高，在蘋果渣、蘋果渣+油渣及蘋果渣+豆粕原料中，混菌接種較不接菌對照純蛋白質(zhì)含量分別提高36.0%、37.8%及26.1%。

2.2 發(fā)酵劑及原料配比對發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量的影響（見表2）

表2 原料組成及混接比例（Cu∶UA8）對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量的影響

2.2.1 原料配比

從表2看出，蘋果渣與油渣配比不同時，發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)不同。Cu與UA8按1∶1比例混接時，不同原料配比發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母菌Cu活菌數(shù)（106個/g）按蘋果渣∶油渣9∶1（301）＞8∶2（92）＞7∶3（36）＞單純蘋果渣（1.9）排列。Cu與UA8按10∶1；100∶1混接時，Cu的菌數(shù)排序與之類似。添加油渣后酵母菌活菌數(shù)明顯高于單純蘋果渣發(fā)酵，其中蘋果渣與油渣比例為9∶1時酵母菌活菌數(shù)較多。由此可知，適當(dāng)添加少量油渣量可使發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)大幅度增加。

從表2看出，不同原料配比發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量不同。Cu與UA8按10∶1比例混接時，不同原料配比發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)含量（g/kg）按蘋果渣∶油渣8∶2（309.6）＞7∶3（291.5）＞9∶1（281.7）＞10∶0純蘋果渣（194.8）排列；Cu與 UA8混接比例為1∶1和100∶1時，蛋白質(zhì)含量排序與之大致相似。由此可看出，添加油渣后發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)含量大幅度增加，但不同配比之間差異不大。

2.2.2 發(fā)酵劑菌種組成比例

從表2看出，發(fā)酵劑菌種組成比例不同，發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)不同。原料組成為單純蘋果渣時，不同混接比例下，發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌Cu活菌數(shù)（106個/g）按Cu∶UA8混接比例10∶1（101.1）＞100∶1（19.2）＞1∶1（1.9）排列；添加油渣后亦表現(xiàn)為混接比例10∶1時發(fā)酵產(chǎn)物酵母菌活菌數(shù)較多。由此可知，適當(dāng)加大酵母菌的接種量（Cu∶UA8=10∶1）能提高發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)。

從表2還可看出，發(fā)酵劑菌種組成不同時發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量不同。原料為純蘋果渣時，混合發(fā)酵劑中菌種混合比例不同，發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量（g/kg）差異不大，如Cu∶UA8為1∶1；10∶1及100∶1時，發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)含量（g/kg）分別為177.5、194.8及185.0，較不接菌對照分別提高24.9%、37.1%及30.2%，表現(xiàn)為Cu∶UA8為10∶1時效果最好；在添加油渣后原料配比為8∶2，Cu∶UA8為1∶1；10∶1及100∶1時，發(fā)酵產(chǎn)物的純蛋白質(zhì)含量分別較不接菌對照提高15.9%、26.4%及6.0%，亦表現(xiàn)出Cu∶UA8為10∶1時純蛋白質(zhì)增幅最大。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在蘋果渣與油渣或者豆粕的不同原料組合中，混接處理的發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌細胞數(shù)及純蛋白質(zhì)含量均高于單接酵母菌處理。其原因在于黑曲霉UA8產(chǎn)生的纖維素酶、蛋白酶及果膠酶等水解酶類可將蘋果渣中的纖維素、果膠等碳水化合物及蛋白質(zhì)水解為小分子糖及氨基酸等，為酵母菌的生長提供充足的碳能源、氮源及生長因子等，促進了酵母菌大量繁殖，進而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)及菌體蛋白質(zhì)大幅度提高。混合菌劑中，當(dāng)黑曲霉所占比例過高（Cu∶UA8=1∶1）或過低Cu∶UA8=100∶1）時，或因混菌發(fā)酵體系中黑曲霉大量生長，通過營養(yǎng)及空間競爭抑制酵母菌繁殖，或因接入的黑曲霉量過少，影響蘋果渣中大分子碳水化合物水解為小分子糖類，造成營養(yǎng)不足，均可導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌數(shù)量較少。

另外，本研究結(jié)果表明，以同樣的比例向蘋果渣中加入油渣及豆粕時，添加油渣處理的酵母菌數(shù)與純蛋白質(zhì)含量均高于豆粕，其原因與油渣中植物蛋白質(zhì)含量較高，在黑曲霉產(chǎn)生的多種水解酶作用下形成的小分子氨基酸類物質(zhì)，對酵母菌生長繁殖更為有利，所形成的酵母菌細胞及菌體蛋白均多有關(guān)。

目前，對蘋果渣發(fā)酵飼料的研究主要集中于提高發(fā)酵飼料中蛋白質(zhì)含量的工藝優(yōu)化及氨基酸變化[12-16]，但對發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活細胞數(shù)關(guān)注不多，進而影響了對發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值的綜合評價。酵母菌細胞中含有豐富的多種營養(yǎng)成分及B族維生素等活性成分，對動物具有直接營養(yǎng)作用，能促進腸道微生物繁殖并增強其活性，穩(wěn)定胃腸道微生物區(qū)系，具有強化營養(yǎng)，提高免疫力和抗病促生功能；酵母菌細胞壁中大量存在的β-葡聚糖和甘露寡糖具有多種免疫功能[8-9]。因此，發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母菌細胞數(shù)量也是發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，該指標(biāo)可反映發(fā)酵過程中酵母菌的繁殖量及其各種活性代謝產(chǎn)物累積量。本研究還發(fā)現(xiàn)，蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)與純蛋白質(zhì)含量具有相同的變化趨勢，即能提高純蛋白含量的工藝措施對酵母菌活菌數(shù)有同樣的增加作用。該結(jié)果將為蘋果渣固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化提供重要的實驗依據(jù)，并為發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

在蘋果渣中添加油渣和豆粕，采用酵母菌與黑曲霉混合發(fā)酵均能顯著同步提高發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量。其中添加油渣處理效果優(yōu)于豆粕，且蘋果渣與油渣比例為9∶1時，發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量均較高；采用混合發(fā)酵劑時，發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母菌數(shù)量均高于酵母菌單獨接種，且適當(dāng)加大酵母菌接種量能大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中酵母菌活菌數(shù)和純蛋白質(zhì)含量，當(dāng)酵母菌∶黑曲霉為10∶1比例時，發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母菌活菌數(shù)及純蛋白質(zhì)含量均最高。