劉曉清

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γ-干擾素釋放試驗體液(漿膜腔積液和腦脊液)檢測診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用

劉曉清

結(jié)核病仍為全球重大公共衛(wèi)生問題，中國結(jié)核病負(fù)擔(dān)高，肺外結(jié)核較其他國家所占比例大。而肺外結(jié)核常見形式——結(jié)核性漿膜腔炎的診斷金標(biāo)準(zhǔn)(病原學(xué)或病理)有敏感度差等不足，因此找到一種新的敏感度高、較快速的結(jié)核性漿膜腔積液的診斷方法十分必要，以提高結(jié)核病的早期診斷水平，對結(jié)核病的防控具有重要意義。

結(jié)核, 胸膜/診斷； 腹膜炎, 結(jié)核性/診斷； 心包炎, 結(jié)核性/診斷； 干擾素γ釋放試驗

目前結(jié)核病仍屬重大全球公共衛(wèi)生問題，中國在全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中居第二位[1]。在中國，肺外結(jié)核占所有活動性結(jié)核病的9.2%～11.2%[2]，而在兒童中，這個比率為23.5%[3]。

肺外結(jié)核的常見形式為結(jié)核性漿膜腔積液，包括結(jié)核性胸膜炎、腹膜炎及心包炎，而且也是漿膜腔積液的常見病因，尤其是在結(jié)核病高流行地區(qū)[4-6]。漿膜腔積液培養(yǎng)或組織活檢病理學(xué)檢查被認(rèn)為是結(jié)核性漿膜腔類診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是，上述兩種方法存在所需時間長、敏感度差、具有有創(chuàng)性等缺點。根據(jù)我國臺灣的一項研究，胸腔積液培養(yǎng)敏感度僅為63%，盡管這已經(jīng)高于之前的報道；而對于胸膜活檢，報道的敏感度相似，為74%[7]。

γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assays, IGRAs)通過檢測由Mtb基因組差異區(qū)1(region of difference, RD1)基因編碼的Mtb特異性抗原刺激效應(yīng)T淋巴細(xì)胞而分泌的γ-干擾素(IFN-γ)以判斷有無結(jié)核感染。目前，已成為敏感度及特異度均較高、無創(chuàng)且較快速的結(jié)核病輔助診斷手段。近年來國內(nèi)有IGRAs輔助診斷結(jié)核性胸膜炎和結(jié)核性腹膜炎等肺外結(jié)核的報道，其中胸腔積液和腹腔積液等體液采用IGRAs檢測的敏感度和特異度高達(dá)90%以上[8]。筆者就IGRA體液(漿膜腔積液和腦脊液)檢測診斷結(jié)核病的臨床應(yīng)用進(jìn)行闡述和討論。

IGRAs檢測結(jié)核感染的原理

一、基本原理[8]

受到Mtb抗原刺激致敏的T淋巴細(xì)胞再次遇到同類抗原時可產(chǎn)生IFN-γ，IGRAs通過檢測全血或分離自全血的單個核細(xì)胞在Mtb特異性抗原刺激下產(chǎn)生的IFN-γ，判斷受試者是否為結(jié)核感染。人體感染Mtb后初始T淋巴細(xì)胞主要分化為Mtb抗原特異性的效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，后者又分為中央型記憶T細(xì)胞和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞,當(dāng)再次接受Mtb抗原多肽時發(fā)生快速增殖，并分泌細(xì)胞因子，其中包含大量的IFN-γ。IGRAs的實質(zhì)是檢測Mtb抗原特異性T淋巴細(xì)胞在體外對Mtb特異性抗原刺激后的反應(yīng)，與檢測標(biāo)本中Mtb抗原特異性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和反應(yīng)能力存在相關(guān)性。

二、臨床應(yīng)用原理

許多研究認(rèn)為在活動性結(jié)核病患者中，Mtb特異性的IFN-γ釋放高于潛伏結(jié)核感染(LTBI)患者，可能是由于Mtb菌量不同導(dǎo)致反應(yīng)強(qiáng)度不同。但是在活動性結(jié)核感染患者中也有較LTBI反應(yīng)弱的患者，可能是由于免疫失能所致[1]。結(jié)核病灶局部特異性效應(yīng)淋巴細(xì)胞的分布密度要高于外周血，但在滲出液中是否如此，尚需有細(xì)胞計數(shù)的對比分析。抗原特異性T淋巴細(xì)胞在胸膜腔中區(qū)域化在之前的研究中曾有報道[9]，而且在小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)了T淋巴細(xì)胞在胸膜腔中的聚集，Mtb特異性的T淋巴細(xì)胞聚集是選擇素介導(dǎo)的遷徙及局部增殖的結(jié)果[10]。在結(jié)核性胸膜炎患者中，胸腔積液中的許多細(xì)胞因子如IFN-γ較外周血中高。所以，在感染部位對Mtb特異性分泌IFN-γ的T淋巴細(xì)胞濃度進(jìn)行測定，使結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測漿膜腔積液較檢測外周血對于診斷結(jié)核性漿膜腔積液價值更高[1]。目前，國際上IGRAs技術(shù)有3種：(1)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)檢測全血中致敏T細(xì)胞再次受到Mtb特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平，稱之為全血檢測或結(jié)核感染T細(xì)胞免疫檢測；(2)采用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ellzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)測定在Mtb特異性抗原刺激下，外周血單個核細(xì)胞中能夠釋放IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，稱之為細(xì)胞檢測或結(jié)核感染T細(xì)胞檢測；(3) 檢測在Mtb特異性抗原刺激下，外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)液中IFN-γ的量。上述3種檢測方法的原理類似，檢測技術(shù)和操作程序略有不同，均采用Mtb的RDl區(qū)基因編碼抗原多肽作為特異性抗原，主要有相對分子質(zhì)量為6000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相對分子質(zhì)量為10 000的培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)抗原或抗原多肽。有些產(chǎn)品在此基礎(chǔ)上增加了TB7.7抗原多肽。后兩種方法均可去除全血方法的一些干擾因素，如在免疫抑制的患者中，去除免疫活性的T細(xì)胞數(shù)量存在的個體差異，但對技術(shù)和實驗條件也要求較高。

IGRAs臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，IGRAs檢測的適應(yīng)證主要包括LTBI的診斷和活動性結(jié)核病的輔助診斷?，F(xiàn)有關(guān)于IGRAs應(yīng)用的絕大部分指南來自結(jié)核病低負(fù)擔(dān)的發(fā)達(dá)國家，歐美等發(fā)達(dá)國家通常推薦將IGRAs用于輔助診斷Mtb感染[8]。

近幾年來，國內(nèi)有IGRAs(僅限于ELISPOT方法)輔助診斷結(jié)核性胸膜炎和結(jié)核性腹膜炎等肺外結(jié)核的報道[11-12]，其中采用胸腔積液和腹腔積液等體液檢測的IGRAs的敏感度和特異度高達(dá)90%以上。此類研究報道數(shù)量不多，病例數(shù)也不足，且目前我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)批準(zhǔn)的IGRAs僅限于血液樣本的檢測，即IGRAs對體液或組織標(biāo)本的研究尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗證[8]。

一、IGRAs(ELISPOT方法)漿膜腔積液和腦脊液檢測技術(shù)流程[12]

1.制備漿膜腔積液單個核細(xì)胞：(1)100 ml無菌生理鹽水瓶采集患者胸腔積液或腹腔積液或心包積液約50 ml，每100 ml加2500 IU(0.4 ml)肝素抗凝； (2)取抗凝后胸腔積液或腹腔積液或心包積液標(biāo)本40 ml，相對離心力800×g，離心5 min后棄去上清，將管底細(xì)胞懸起；(3)10 ml生理鹽水洗滌，相對離心力800×g，離心5 min后棄去上清；(4)用4 ml生理鹽水將收集到的胸腔積液或腹腔積液或心包積液中單個核細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；(5)取人淋巴細(xì)胞分離液4 ml入15 ml滅菌離心管內(nèi)；(6)用5 ml加樣器充分混勻“步驟4”制成的細(xì)胞懸液，在距分層液1 cm處沿試管壁徐徐加入，使細(xì)胞懸液重疊于分層液上；(7)相對離心力900×g，無剎車離心20 min；(8)吸出單個核細(xì)胞層，移入另一15 ml離心管中；(9)10 ml生理鹽水洗滌，相對離心力800×g，離心5 min后棄去上清；(10)用10 ml AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸混勻，取25 μl細(xì)胞懸液至75 μl 0.4%臺盼藍(lán)中，混勻，取樣加入血細(xì)胞計數(shù)板，顯微鏡下計數(shù)；(11)相對離心力500×g，離心7 min后棄去上清，用AIM-V培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.5×106/ml。

2.制備腦脊液單個核細(xì)胞：(1)無菌小瓶采集患者腦脊液，每4 ml加入100 IU(約0.02 ml)肝素抗凝；(2)在15 ml高壓滅菌離心管中用生理鹽水將標(biāo)本稀釋至10 ml；(3)相對離心力500×g，離心7 min后棄去上清，將管底細(xì)胞懸起；(4)10 ml生理鹽水洗滌，相對離心力500×g，離心7 min后棄去上清；(5)用10 ml AIM-V培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸混勻，取25 μl細(xì)胞懸液至75 μl 0.4%臺盼藍(lán)中，混勻，取樣加入血細(xì)胞計數(shù)板，顯微鏡下計數(shù)；(6)相對離心力500×g，離心7 min后棄去上清，用AIM-V培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2.5×106/ml。

3. T-SPOT.TB檢測：(1)在已包被抗IFN-γ單抗的96孔板上，分別單孔加入50 μl細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對照，50 μl植物血凝素作為陽性對照，分別以50 μl Mtb特異性ESAT-6和CFP-10肽段庫(終濃度10 μg/ml)作為刺激原(英國牛津免疫技術(shù)公司出品)；(2)每孔中加入100 μl漿膜腔積液單個核細(xì)胞懸液(濃度為2.5×106/ml)；(3)將96孔板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 16～18 h；(4)按200 μl/孔加入1×PBS(磷酸鹽緩沖液)，靜置30 s后甩去，重復(fù)4次；(5)用1×PBS按1∶200比例稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，50 μl/孔加入稀釋液，保鮮膜包好，置4 ℃冰箱1 h；(6)重復(fù)“步驟4”；(7)每孔加入顯色底物液5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽-四氮唑藍(lán)(BCIP-NBT)，室溫避光靜置7 min；(8)去離子水終止反應(yīng)，潔凈臺風(fēng)口處吹干；(9)觀察結(jié)果，并用ELISPOT 計數(shù)儀(AID iSPOT Reader Spectrum，德國)進(jìn)行斑點閱讀與統(tǒng)計。

二、漿膜腔積液及腦脊液IGRAs檢測對于結(jié)核性漿膜炎及結(jié)核性腦膜炎的診斷價值

根據(jù)近年來報道，T-SPOT.TB檢測漿膜腔積液較檢測外周血敏感度及特異度均較高。一項多中心的研究數(shù)據(jù)顯示與外周血T-SPOT.TB檢測相比，胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度由76%提高至95%，特異度由67%提高至95%[13]。

根據(jù)一項北京協(xié)和醫(yī)院187例患者的隊列研究報道，漿膜腔積液T-SPOT.TB檢測較外周血的敏感度 (91.9%及73.0%,P=0.002)、特異度(87.1%及73.1%,P=0.017)、陽性預(yù)測值(85.0%及68.4%,P=0.013)及陰性預(yù)測值 (93.1%及77.3%,P=0.003)均高。胸腔積液、腹腔積液及心包積液的T-SPOT.TB 檢測敏感度分別為88.9%, 94.4% 及100.0%[1]。

SFDA推薦了24個斑點形成細(xì)胞(SFCs)/106PBMC(即6個SFCs/2.5×105PBMCs)作為外周血T-SPOT.TB的臨界值(cutoff值)診斷活動性及潛伏結(jié)核感染。對于結(jié)核性漿膜腔積液的診斷，上述研究[1]顯示漿膜腔積液的T-SPOT.TB檢測以56個SFCs/106SEMC(漿膜腔積液單個核細(xì)胞)，即14個SFCs/2.5×105SEMC作為cutoff值,受試者操作特性曲線(ROC)下面積最大，其敏感度及特異度分別為90.5% 和89.2%。

一項來自韓國結(jié)核性腹膜炎患者的研究顯示，腹腔積液ELISPOT (24個SFCs/106SEMC，即6個SFCs/2.5×105SEMC作為cutoff值)檢測的敏感度及特異度分別為87%和86%[14]。

一項中國深圳結(jié)核性胸膜炎患者的研究顯示，胸腔積液ELISPOT 檢測的敏感度及特異度分別為95.7%及100.0%，均高于外周血(78.3%及86.3%)[15]。

一項中國北京胸科醫(yī)院結(jié)核性胸膜炎患者的研究顯示,胸腔積液T-SPOT.TB檢測的敏感度與外周血相近 (96.3%及92.7%) (P=0.691)；而胸腔積液T-SPOT.TB檢測的特異度(94.5%) 遠(yuǎn)高于外周血(76.1%) (P=0.002)。cutoff值為216個SFCs/106PFMCs(胸腔積液單個核細(xì)胞)[16]。

在非亞洲國家中，一項來自南非的對結(jié)核性胸膜炎患者的研究顯示，胸腔積液γ-干擾素濃度cutoff值定為0.83 IU/ml，敏感度為 87%，特異度為71%[17]。一項土耳其結(jié)核性胸膜炎患者的研究顯示，使用改良的QuantiFERON?-TB Gold In-Tube test(QFT-GIT)試劑盒(以ESAT-6、CFP-10和TB7.7合成多肽為刺激抗原，TB7.7位于RD13)診斷結(jié)核性胸膜炎，其敏感度及特異度分別為48.8% 及79.3%[18]。

韓國Kim等[19]一項包括37例疑診結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液和外周血T-SPOT.TB檢測的研究，12例患者診斷為結(jié)核性腦膜炎，25例患者除外了活動性結(jié)核病，腦脊液ELISPOT檢測的敏感度及特異度分別為75% (95%CI：19%～99%)和75% (95%CI： 43%～95%)。該研究結(jié)果顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)Mtb感染患者腦脊液與外周血T-SPOT.TB檢測的SFCs數(shù)比值中位數(shù)ESAT-6抗原為5.2，CFP-10抗原為2.9。當(dāng)以腦脊液與外周血的SFCs比值大于或等于2為cutoff時，檢測敏感度為50%(95%CI：7%～93%)，特異度為100%(95%CI：74%～100%)。

一項來自印度的結(jié)核性腦膜炎患者的IGRAs研究，包括11例患者診斷為結(jié)核性腦膜炎，9例患者除外了結(jié)核性腦膜炎。結(jié)果顯示，腦脊液ELISPOT檢測的敏感度為90% (95%CI：56%～100%)，特異度為100% (95%CI：59%～100%)，腦脊液與外周血檢測的SFCs數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[20]。

但以上研究的患者例數(shù)均不多，且不同試劑的研究存在人群入組標(biāo)準(zhǔn)、所用IGRAs檢測試劑和判斷標(biāo)準(zhǔn)等不一致的問題，目前還難以獲得漿膜腔積液和腦脊液IGRAs在臨床應(yīng)用的充分循證數(shù)據(jù)。

三、幾點建議

歸納不同指南的觀點，主要有以下相對一致或相近的建議[8]：(1)IGRAs不能有效區(qū)分活動性結(jié)核病和LTBI，因此IGRAs對活動性結(jié)核病的診斷價值有限，尤其在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家；(2)無論是特異度還是敏感度，IGRAs均優(yōu)于或至少不差于PPD試驗，因此在診斷LTBI方面，發(fā)達(dá)國家多推薦單獨或聯(lián)合應(yīng)用IGRAs。

PPD試驗和IGRAs均無法區(qū)分LTBI和活動性結(jié)核病患者。國內(nèi)IGRAs的研究數(shù)據(jù)顯示其敏感度和特異度差別較大，敏感度為53%～98%，特異度為60%～90%(或以上)，但多數(shù)文獻(xiàn)報道的敏感度和特異度>70%，提示IGRAs的特異度優(yōu)于PPD試驗[8]。考慮到我國肺結(jié)核患者中菌陰肺結(jié)核所占比例較高，在診斷這類患者缺乏細(xì)菌學(xué)依據(jù)時，IGRAs可發(fā)揮其輔助作用。故建議：(1)IGRAs不能用于確診或排除活動性結(jié)核病，但對缺少細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)的活動性結(jié)核病(如菌陰肺結(jié)核等)，IGRAs可在常規(guī)診斷依據(jù)的基礎(chǔ)上，起到補(bǔ)充或輔助診斷的作用；(2)IGRAs檢測胸腔積液和腹腔積液等非血液標(biāo)本的檢測程序、判斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷效能有待進(jìn)一步研究[8]。

小 結(jié)

中國為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，且肺外結(jié)核占有一定比例，鑒于肺外結(jié)核病原學(xué)及病理診斷陽性率均較低，找到一種較好的診斷方法尤為重要。肺外結(jié)核以漿膜炎為常見，目前研究均顯示漿膜腔積液IGRAs檢測的敏感度與特異度較外周血高，但報道數(shù)量不多，各個報道的患者例數(shù)也不足，因此對非血液的體液標(biāo)本進(jìn)行IGRAs的研究尚需進(jìn)一步經(jīng)過大樣本研究進(jìn)行驗證，從而得出更可靠的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。IGRAs檢測胸腔積液和腹腔積液等非血液標(biāo)本的檢測程序、判斷標(biāo)準(zhǔn)和診斷效能均有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：薛愛華)

The clinical application of IGRA test in body fluid (serositis and cerebral spinal fluid) for diagnosis of tuberculosis

LIU Xiao-qing.

Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730, China

LIU Xiao-qing，Email：liuxqpumch@126.com

Tuberculosis remains the great global health problem, and the disease burden is high in China. The proportion of extrapulmonary tuberculosis is more than other countries. Tuberculosis serositis is the most common form of extrapulmonary tuberculosis, but the golden diagnosis criterion of tuberculosis serositis has some shortcomings such as a low sensitivity and so on. Therefore, to discover a rapid diagnostic method of high sensitivity is necessary to diagnose tuberculosis in early stage, which is vital for control and prevention of tuberculosis.

Tuberculosis, pleural/diagnosis； Peritonitis, tuberculous/diagnosis； Pericarditis, tuberculous/diagnosis； Interferon-gamma release tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.003

100730 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院感染科

劉曉清，Email：liuxqpumch@126.com

2015-02-28)