劉源 張崧 葉平?

載脂蛋白A-I模擬物的功能

劉源 張崧 葉平?

近年，載脂蛋白A-I模擬物療法這一相對(duì)較新的領(lǐng)域取得許多重要進(jìn)展，支持其不僅有治療心血管疾病的強(qiáng)大潛力，同時(shí)涉及慢性炎癥和氧化以及其他疾病狀態(tài)的治療。正在開發(fā)中的各種載脂蛋白A-I模擬肽均顯示出強(qiáng)有力的心臟保護(hù)功能，可媲美甚至超越全長載脂蛋白A-I（apoA-I）和高密度脂蛋白（HDL），本文旨在探討這些肽分別負(fù)責(zé)哪些不同的功能，同時(shí)確定其結(jié)構(gòu)特征和運(yùn)行機(jī)制。

1 膽固醇流出功能

迄今為止，HDL最主要被研究的功能是促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）的能力。探討載脂蛋白A-I模擬肽促進(jìn)RCT的研究主要是針對(duì)單螺旋肽和雙螺旋肽，其中的一些肽在促進(jìn)CE的過程中表現(xiàn)出可以與全長apoA-I相似甚至超越的能力。如雙螺旋模擬肽5A在脂質(zhì)貧乏時(shí)可以通過介導(dǎo)ABCA1促進(jìn)膽固醇流出，而非ABCG1，而且5A與合成的磷脂棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿（POPC）聯(lián)合應(yīng)用會(huì)增加3倍的膽固醇流出，這一過程主要是通過增強(qiáng)非特異性水溶液擴(kuò)散的作用。在易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的apoE基因缺陷小鼠靜脈給予5A/POPC，循環(huán)高密度脂蛋白通過增加ABCA1和ABCG1的水平使得磷脂和膽固醇流出增加［1］。該研究還通過追蹤放射性膽固醇從巨噬細(xì)胞到糞便的運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)5A/POPC輸液增加了全身的RCT。另有研究關(guān)注一種被稱為ETC-642的多肽/脂質(zhì)復(fù)合物，它是由單螺旋肽ESP 24218，鞘磷脂，和1，2 -二棕櫚酰-sn-甘油基-3 -磷酸膽堿（DPPC）以質(zhì)量比1：3.75：3.75合成的。ETC-642對(duì)膽固醇流出人類巨噬細(xì)胞這一過程表現(xiàn)出劑量依賴性的影響，這與脂化全長載脂蛋白A-I（apoA-I/ POPC）的效果相似。

為明確雙螺旋肽對(duì)高密度脂蛋白功能的影響，其各種結(jié)構(gòu)特征已被探測。許多的特征對(duì)膽固醇流出的效率和特異性有顯著的影響，包括疏水性，疏水面的大小，電荷和多肽連接橋的靈活性等，最終確定-0.5的平均疏水性值是最理想的，而增加疏水面的尺寸、維持電中性和橋的靈活性都對(duì)膽固醇流出有益。利用這一研究結(jié)果，一個(gè)“理想的”肽ELK-2A2K2E被設(shè)計(jì)出來，它被證明有很高的促進(jìn)膽固醇流出的能力，明顯比全長載脂蛋白A-I更有效。

除了提高合成肽在一個(gè)特定的功能，如膽固醇流出中的作用更有效，研究者還努力增加它們的生物穩(wěn)定性和可用性。載脂蛋白A-I模擬肽的螺旋結(jié)構(gòu)被一種稱為烴縫合的技術(shù)而穩(wěn)定化合成，即在兩圈螺旋結(jié)構(gòu)之間引入共價(jià)鍵。這種連接是針對(duì)螺旋的特殊位點(diǎn)，防止其解旋，穩(wěn)定其對(duì)抗高溫和蛋白酶變性。此修改不僅可以增加一個(gè)給定肽的膽固醇流出能力，也代表可以減少腸道蛋白水解的潛在手段，從而增加口服肽的生物利用度。應(yīng)用于幾個(gè)現(xiàn)有模擬肽的另一種方法是以D型的氨基酸合成的，而不是天然存在的L型異構(gòu)體。這種合成方式能讓其抵御腸道蛋白水解酶的作用，同時(shí)保留了生物物理特性以及大多數(shù)生物功效［2］。

2 抗炎功能

如前所述，高密度脂蛋白可以通過各種機(jī)制抑制炎癥過程，目前模擬肽被證明能復(fù)制這些活動(dòng)，如ETC-642。在體外，ETC-642處理人頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAECs）可以降低由TNF-α刺激的THP-1單核細(xì)胞的粘附和減少VCAM-1、MCP-1和NK-κB的mRNA表達(dá)。在體內(nèi)，研究者利用新西蘭白兔制成一個(gè)增加ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的血管炎癥模型，以前的研究表明，載脂蛋白A-I和HDL都可以在這個(gè)模型中降低細(xì)胞粘附分子的表達(dá)［3］，而靜脈注射30mg/kg ETC-642同樣可以逆轉(zhuǎn)兩個(gè)粘附分子的增加。

研究表明，單螺旋肽4F可以影響發(fā)展為疾病狀態(tài)的炎癥心血管疾病所導(dǎo)致的炎癥。在一個(gè)小規(guī)模的臨床研究中，感染了艾滋病病毒并接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法的患者被發(fā)現(xiàn)有較高的HDL炎癥指數(shù)（HII），表明這些患者的HDL在調(diào)節(jié)炎癥方面的缺陷。然而，隨著4F治療這些患者的HDL的抗炎活性恢復(fù)［4］。在大鼠慢性腎臟疾?。–KD）模型中，4F的皮下給藥減少血管脂質(zhì)沉積和由5/6腎切除術(shù)導(dǎo)致的炎癥。這些報(bào)道支持載脂蛋白A-I模擬肽具有廣泛的抗炎功能，推動(dòng)進(jìn)一步研究其用于治療非心血管疾病相關(guān)的炎癥性疾病的潛在用途。

載脂蛋白A-I模擬肽可以影響抗炎活性的結(jié)構(gòu)特征也被探究。雙螺旋肽兩個(gè)螺旋之間的不對(duì)稱性被認(rèn)為是其抑制單核細(xì)胞表達(dá)CD11b最重要的因素，例如將對(duì)稱的肽ELK的第二螺旋改變，使得它不再與第一螺旋相同，該肽抑制CD11b表達(dá)的能力會(huì)有所增加。此外，維持中性或陰性的凈電荷以及＜180°的疏水面也對(duì)抗炎能力有好處。也有研究發(fā)現(xiàn)，可以影響抗炎癥反應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征在不同細(xì)胞類型中發(fā)揮的作用是不同的，與CD11b在巨噬細(xì)胞表達(dá)相比，VCAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)受多肽螺旋不對(duì)稱性的影響很輕微，而增加疏水性表面的大小以及凈正電荷的肽被發(fā)現(xiàn)是有利的。這一觀察結(jié)果顯示了人工精心設(shè)計(jì)的模擬肽在對(duì)炎癥的選擇性干預(yù)方面有巨大的潛力。

3 抗氧化功能

氧化的低密度脂蛋白（oxLDLs）是血管壁發(fā)生炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)強(qiáng)效的觸發(fā)器。載脂蛋白A-I模擬物與健康人的高密度脂蛋白和載脂蛋白A-I一樣可以通過多種機(jī)制抑制或阻止低密度脂蛋白脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化修飾，包括（1）作為活性氧和氧化脂質(zhì)的直接清除劑。（2）抑制氧化啟動(dòng)物質(zhì)如12 -脂氧合酶的作用。（3）抑制與高密度脂蛋白活動(dòng)相關(guān)的酶如PON1和PAF-AH的活性。前文關(guān)于載脂蛋白A-I模擬肽的抗炎特性所討論的大鼠慢性腎病模型，對(duì)載脂蛋白A-I模擬物的抗氧化功能也進(jìn)行了觀察。在此模型中，腎功能減退導(dǎo)致系統(tǒng)性氧化應(yīng)激的增加，用4F處理后主動(dòng)脈壁中蛋白質(zhì)的氧化產(chǎn)物（硝基酪氨酸）的數(shù)量會(huì)降低，血漿和尿中的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物（丙二醛）的濃度也降低。4F還通過影響抗氧化酶減少氧化應(yīng)激。錳超氧化物歧化酶（MnSOD）是一種催化超氧負(fù)離子生成水和過氧化氫的抗氧化劑酶，在卵巢癌細(xì)胞株，4F治療增加MnSOD的表達(dá)水平和活性［5］。

對(duì)于影響載脂蛋白A-I模擬肽抗氧化能力的結(jié)構(gòu)特征，研究證實(shí)包含半胱氨酸或組氨酸的雙螺旋模擬肽ELK和5A會(huì)增加其抑制LDL脂質(zhì)氧化的能力。其他一些結(jié)構(gòu)變化如利用一個(gè)丙氨酸殘基取代脯氨酸從而改變肽連接鍵的靈活性，或轉(zhuǎn)換到G型或Y型螺旋都會(huì)增加其抗氧化的能力。

4 新興領(lǐng)域

炎癥和氧化是除了心血管疾病之外許多疾病的共同特點(diǎn)，因此，載脂蛋白A-I模擬肽的抗炎和抗氧化作用可能在其他與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病狀態(tài)也很有用。目前的研究主要包括以下幾個(gè)方面。

4.1 抗腫瘤功能 已有研究表明載脂蛋白A-I及其模擬肽對(duì)小鼠卵巢癌模型中抑制腫瘤的發(fā)展能產(chǎn)生有利影響，其中首先發(fā)現(xiàn)的是，當(dāng)被注入了上皮性卵巢腺癌細(xì)胞系（ID8細(xì)胞）后，載脂蛋白A-I轉(zhuǎn)基因小鼠比野生型小鼠的生存時(shí)間更長，抑制了腫瘤發(fā)展。隨后對(duì)載脂蛋白A-I模擬肽的研究發(fā)現(xiàn)，在體外，用4F和5F處理ID8細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞活力和增殖減少，在體內(nèi)，皮下注射4F能降低腫瘤質(zhì)量和體積，這種效果可能是由于載脂蛋白A-I模擬物治療的動(dòng)物增加了溶血磷脂酸（LPA），一種已知可促進(jìn)腫瘤發(fā)生的溶血磷脂，與高密度脂蛋白結(jié)合的結(jié)果［6］。如前所述4F能誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞抗氧化酶MnSOD表達(dá)和活性升高，也有助于4F發(fā)揮抗腫瘤效果。5F肽可以通過另外的機(jī)制，如抑制血管生成，以防止腫瘤的發(fā)展。

4.2 抗哮喘功能 哮喘是一種慢性疾病，特點(diǎn)是氣喘、咳嗽、呼吸急促，是由于肺部氣道的過度炎癥反應(yīng)所致。因?yàn)檩d脂蛋白A-I模擬肽已知的抗炎的特性，研究人員推測，其可以作為一種治療哮喘的有效方法。利用5A肽治療由塵螨誘發(fā)的小鼠哮喘模型可以阻礙哮喘相關(guān)的特征，包括氣道高反應(yīng)性及氣道重塑的發(fā)展［7］。5A治療還減少了支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的數(shù)量，可能是減少了細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)的結(jié)果。

4.3 對(duì)膿毒癥的作用 由脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠膿毒癥模型會(huì)導(dǎo)致低血壓，主要是通過激活核因子-κB信號(hào)后增加了一氧化氮生成酶NOS2表達(dá)的結(jié)果。在此模型注射4F后會(huì)促進(jìn)LPS被HDL有效的中和，改善血管的收縮［8］。HDL螯合LPS的能力既往已知，但4F肽似乎可以明顯增強(qiáng)這種效果。表面等離子體共振技術(shù)已經(jīng)證明，4F對(duì)促炎氧化脂類的結(jié)合力比載脂蛋白A-I高4～6個(gè)數(shù)量級(jí)，這很可能是該肽能發(fā)揮強(qiáng)效抗炎特性的一個(gè)主要因素。

4.4 對(duì)SLE的作用 4F肽也可以在自身免疫疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）中發(fā)揮作用。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡與加速動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠模型中，4F能減少自身抗體產(chǎn)生，減輕骨質(zhì)稀少和腎小球腎炎等與SLE導(dǎo)致的癥狀［9］。這些有益的效果很大程度上是由于apoA-I/HDL/模擬肽公認(rèn)的保護(hù)機(jī)制，包括抑制VCAM-1和隔離氧化磷脂。應(yīng)用4F治療后的模型小鼠主動(dòng)脈損傷面積增加，但會(huì)增加更多的平滑肌區(qū)域，降低巨噬細(xì)胞區(qū)域，形成一個(gè)更穩(wěn)定的組分分布。

5 對(duì)心血管疾病的影響

上述的各項(xiàng)研究表明，高密度脂蛋白許多的心臟保護(hù)作用，可以被顯著的特異性使用模擬肽所概括。此外，載脂蛋白A-I模擬肽治療至今還未出現(xiàn)較大的毒性問題。因此，許多研究人員現(xiàn)在已經(jīng)開始在動(dòng)脈粥樣硬化的各種動(dòng)物模型和臨床研究中，將模擬肽這些能力與心血管結(jié)果及心血管健康的直接測量指標(biāo)相關(guān)聯(lián)。在高脂血癥家兔模型，注射ETC-642后使用血管內(nèi)超聲（IVUS）評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其可以減輕主動(dòng)脈斑塊負(fù)擔(dān)，這種效應(yīng)可能與減少促炎性帶負(fù)電荷的LDL的治療相關(guān)。對(duì)載脂蛋白E基因敲除小鼠的模擬肽注射5A磷脂復(fù)合物后，主動(dòng)脈斑塊面積減少達(dá)53%，機(jī)制可能是增加了膽固醇流出。

4F肽也已被證明對(duì)糖尿病小鼠具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的能力。ApoE基因敲除小鼠給予鏈脲佐菌素誘發(fā)高血糖后，與不給予鏈脲佐菌素的apoE基因敲除小鼠相比，增加了＞3倍的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積。但是，這種動(dòng)脈粥樣硬化面積的增加可以在4F治療后減少近50%［10］。4F還被證明可以增加胰島素敏感性，并防止糖尿病心肌病的發(fā)生。

為比較載脂蛋白A-I模擬物口服和皮下注射這兩種給藥方式的療效是否有區(qū)別，接受西方飲食的apoE基因敲除小鼠被利用而研究。通過不同方式使用的相同劑量4F都會(huì)降低血漿中急性期蛋白血清淀粉樣蛋白A（SAA）的水平，改善HDL炎癥指數(shù)，并抑制大約50%的主動(dòng)脈粥樣硬化。雖然皮下給藥會(huì)使4F血漿水平增加很明顯，但通過任意一種方法使用4F對(duì)于心血管壓力的測量數(shù)值的效果相似。這些數(shù)據(jù)表明，模擬肽的效力是由給定的劑量所決定的，而非給藥方式或血漿濃度。此外，兩種給藥方式在糞便中肽的量是相同的，可能預(yù)示4F肽在胃腸道中起重要作用。

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國家973項(xiàng)目（2013CB530804）

100039 北京解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科 （劉源 葉平）天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院保健醫(yī)療部 （張崧）

*通訊作者