■ 葉 滔 楊靜美 閆 凱 馮 蓓 逯佩鳳 孫丹丹 周玉巖

（1.廣東海納川生物科技股份有限公司，廣東佛山528515；2.廣東省獸藥與飼料添加劑工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東佛山528515；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東廣州 510225）

防御素（defensin）是廣泛存在于生物體中的一類內(nèi)源性抗菌肽（antibacterial peptide），在一定誘導條件下，由宿主細胞特定編碼基因產(chǎn)生的對抗外源性病原微生物的小分子肽類活性物質(zhì)。它具有廣泛的殺菌活性、細胞毒性和免疫趨化活性，是機體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。防御素作用機理獨特，它主要作用于病原菌的細胞膜，因此不易產(chǎn)生耐藥性。另外，研究發(fā)現(xiàn)，防御素還可以作為一種效應(yīng)分子，激活和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤功能，有望在抵御病原菌感染中顯示巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景[2]。

菌絲霉素（Plectasin）是Mygind等（2005）研究小組通過篩查腐生子囊菌（the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella）分泌蛋白的cDNA庫，從中找出一些與無脊柱動物防御素序列高度相似的片段，并篩選分離出來的首例真菌防御素[3]。防御素新藥研發(fā)工作一直進展緩慢，主要障礙就是它們在大規(guī)模生產(chǎn)時成本過高。Plectasin的發(fā)現(xiàn)打破了一直局限在高等生物，如哺乳動物、昆蟲和植物中分離防御素的現(xiàn)狀，將防御素的來源拓展到具有廣闊開發(fā)前景的低等生物真菌中，從真菌中提取防御素獲得成功，必將大幅降低防御素類抗菌藥物的研究和生產(chǎn)成本，從而加速這類新型抗菌藥物的開發(fā)和應(yīng)用，具有重要意義[2]。

圖1 Plectasin與幾種無脊椎動物防御素的相似性

目前制備大量的防御素是研究和應(yīng)用的前提，其主要途徑有三個：①天然提取；②化學合成；③基因工程表達技術(shù)。前兩種方法工藝復雜、成本高，只能滿足研究所需要的樣品量，難以工業(yè)化生產(chǎn)?；蚬こ瘫磉_技術(shù)可以用于表達重組肽，且具有低成本、表達產(chǎn)物活性高的優(yōu)勢，是目前獲取大量外源蛋白的有效方法。因此，本研究采用基因工程技術(shù)，嘗試在畢赤酵母中通過組成型分泌到胞外的方式表達重組肽菌絲霉素NZ2114，并進行重組肽菌絲霉素NZ2114表達的50 L發(fā)酵罐規(guī)模中試研究，研究其體外抗菌活性鑒定，為其在規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌絲霉素NZ2114基因，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

載體pPicZα，由暨南大學醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心惠贈。

畢赤酵母GS115，由暨南大學醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心惠贈。

受試菌：金黃色葡萄球菌CMCC26003，由華中農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)藥理實驗室惠贈。

MHB培養(yǎng)基：MHB肉湯培養(yǎng)基21 g溶于1 L蒸餾水中，充分溶解后，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB瓊脂培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g，定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。配置LB固體培養(yǎng)基時，加入1.5%的瓊脂粉，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至700 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，添加滅菌的10%甘油100 ml，13.4%無氨基酸酵母氮源（YNB）100 ml，0.02%生物素2 ml，1 mol/l磷酸緩沖液pH值6.0 100 ml。

BMMY培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至700 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后，添加滅菌的5%甲醇100 ml，13.4%無氨基酸酵母氮源YNB 100 ml，0.02%生物素2 ml，1 mol/l pH值6.0磷酸緩沖液100 ml。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g，定容至900 ml，121℃高壓蒸汽滅菌20 min后添加過濾滅菌的20%葡萄糖100 ml。

考馬斯亮藍試劑：考馬斯亮藍G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1 000 ml，濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

電泳系統(tǒng)：XCell SureLock?Mini-Cell蛋白垂直電泳槽（美國生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構(gòu)建

NZ2114蛋白序列如下：

抗菌肽Plectasin：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY

菌絲霉素NZ2114：GFGCNGPWNEDDLRCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY

根據(jù)蛋白編碼序列，設(shè)計相對應(yīng)畢赤酵母的酵母偏愛性密碼子，提交生物公司合成。將合成的NZ2114基因克隆到pUC57中，用XhoI、AvrII雙酶切后，將NZ2114基因插入畢赤酵母表達載體pPicZα，位于α因子信號肽突變體序列的下游，得到重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114，并對該質(zhì)粒進行限制性酶切及測序鑒定。將重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114經(jīng)PmeI酶切后，電轉(zhuǎn)到畢赤酵母 GS115 中，用含 500～1 000 μg/ml Zeocin(博萊霉素)的YPD培養(yǎng)基篩選，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，PCR鑒定篩選多拷貝陽性轉(zhuǎn)化子[4]。

1.2.2 菌絲霉素NZ2114基因在畢赤酵母中表達

將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含20 ml BMGY（含Zeocin 500 μg/ml）培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 ml菌液轉(zhuǎn)移至200 ml BMMY誘導培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補加1%的含量100%甲醇，共培養(yǎng)120 h。

1.2.3 菌絲霉素NZ2114組成型表達菌株的中試發(fā)酵

一級種子：上述篩選得到的抗菌活性最強的重組菌株斜面菌種，用接菌針將其接入含YPD培養(yǎng)基100 ml的500 ml錐形瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)17 h；二級種子：按10%的接種量接入含有YPD培養(yǎng)基9 L的20 L發(fā)酵罐，同樣條件下培養(yǎng)約24 h。

50 L罐發(fā)酵：培養(yǎng)在50 L發(fā)酵罐中進行，發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基為25 L的YPD培養(yǎng)基，接種前校正pH值電極和溶氧電極，培養(yǎng)過程中保持通氣量大于60 L/min，發(fā)酵過程中菌體利用葡萄糖產(chǎn)酸，用氨水溶液調(diào)節(jié)pH值5.0，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30.0℃，起始轉(zhuǎn)速為250 r/min，隨著菌體的生長不斷提高轉(zhuǎn)速，發(fā)酵過程中控制溶氧大于20%，培養(yǎng)96 h后放罐。每24 h取少量發(fā)酵液，測定其菌體濕重、葡萄糖殘?zhí)橇?、蛋白含量、抑菌活性以及MIC值。轉(zhuǎn)速、溫度、pH值和溶氧等參數(shù)由發(fā)酵罐自動檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 菌絲霉素NZ2114組成型表達菌株的中試發(fā)酵產(chǎn)物測定

發(fā)酵液蛋白濃度測定：取100 μl的發(fā)酵液溶液于小試管中，用雙蒸水調(diào)整體積到1 ml，然后加入5 ml考馬斯亮藍試劑，充分振蕩混合，5 min后于595 nm測定光吸收值。以1 ml雙蒸水及加5 ml考馬斯亮藍試劑作為空白對照。

發(fā)酵液抑菌活性測定：以金黃色葡萄球菌CMCC26003為實驗菌株，將金黃色葡萄球菌懸浮液（OD600nm=0.5～0.6）50 μl與 46 ℃的 LB 固體培養(yǎng)基100 ml混勻后鋪平板，待其凝固后4℃保存，用無菌打孔器打孔，每孔中滴加待測培養(yǎng)發(fā)酵液上清（誘導0、24、48、72、96 h）5 μl，待孔中液體被培養(yǎng)基吸收完全后，上述平板37℃倒置培養(yǎng)過夜（10～12 h）。以同體積的無菌水培養(yǎng)上清為陰性對照，氨芐青霉素（Amp）為陽性對照。

發(fā)酵液MIC測定：將受試菌CMCC26003在平板劃線，再轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，至對數(shù)生長期，用生理鹽水調(diào)節(jié)受試菌液，使之在OD625nm=0.09～0.1，然后按1∶100稀釋，搖勻。發(fā)酵液菌絲霉素蛋白用微孔濾膜過濾，加入受試菌中，并使終濃度稀釋為1 200、1 500、2 000倍。然后置于37℃條件下，培養(yǎng)12 h?？瞻讓φ諡槲醇影l(fā)酵液和氨芐青霉素。陽性對照為氨芐青霉素（100 μg/ml）。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建與鑒定

以pUC57為模板，利用上下游特異性引物F和R，通過PCR方法獲得編碼菌絲霉素NZ2114蛋白的DNA片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在500 bps附近得到目的條帶，與預期大小相符（見圖2）。PCR擴增得到的基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶（Xho I和AvrII）雙酶切后將NZ2114基因連接到畢赤酵母表達載體pGAPZα上，位于α因子信號肽突變體序列的下游，得到重組質(zhì)粒pPicZα-NZ2114，Zeocin抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子并送生物技術(shù)有限公司進行DNA序列測定。挑取抗性平板上的多拷貝轉(zhuǎn)化子，30℃、220 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體進行PCR鑒定，結(jié)果（見圖2）顯示：NZ2114基因位于α-factor突變體基因下游，二者總共約500 bps，PCR鑒定所得到編碼重組蛋白菌絲霉素NZ2114的DNA序列與預期一致，即所挑取重組子呈陽性轉(zhuǎn)化子。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物

2.2 菌絲霉素NZ2114基因在畢赤酵母中表達

將上述PCR鑒定呈陽性的重組轉(zhuǎn)化子接種于含20 ml BMGY（含Zeocin 500 μg/ml）培養(yǎng)基中的試管中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 ml菌液轉(zhuǎn)移至200 ml BMMY誘導培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補加1%的含量100%甲醇，共培養(yǎng)120 h后，離心收集發(fā)酵液上清。發(fā)酵液上清的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明，重組轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶（見圖3），與菌絲霉素NZ2114蛋白的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴散法測定甲醇誘導重組轉(zhuǎn)化子的抗菌活性結(jié)果也顯示（見圖4），重組轉(zhuǎn)化子甲醇誘導發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。

圖3 甲醇誘導畢赤酵母重組表達菌絲霉素的發(fā)酵液電泳分析

圖4 誘導畢赤酵母重組表達菌絲霉素的發(fā)酵液抑菌活性

2.3 菌絲霉素NZ2114組成型表達菌株的中試發(fā)酵

經(jīng)電泳系統(tǒng)篩選得到工程菌畢赤酵母pPicZα-NZ2114，通過種子活化和二級種子擴增后，轉(zhuǎn)入50 L發(fā)酵罐進行中試發(fā)酵研究。如圖5所示，工程菌畢赤酵母pPicZα-NZ2114接種后0～4 h，菌體濕重緩慢增加，處于適應(yīng)期，4 h后，菌體開始快速生長進入指數(shù)生長期，利用葡萄糖產(chǎn)酸導致pH值下降，緩慢流加氨水維持pH值在5.0左右。至發(fā)酵24 h后，加入甲醇誘導，隨著發(fā)酵誘導時間的延長，抗菌活性增強，甲醇誘導48 h后，菌絲霉素NZ2114在畢赤酵母表達開始進入平臺期，抗菌活性增長緩慢，至甲醇誘導96 h，抗菌活性達到最大，停止發(fā)酵，取發(fā)酵液離心保存上清。結(jié)果顯示：培養(yǎng)0～24 h階段，細胞濕重達到151.23 g/l，菌體細胞數(shù)最大值達到37億個/ml，8 h后的殘?zhí)橇烤S持0.05%；甲醇誘導0～96 h階段，發(fā)酵液菌體濕重保持不變，菌體細胞數(shù)略有下降，蛋白濃度達到606 μg/ml。

圖5 50 L發(fā)酵罐種子在不同時間段的生長情況

2.4 菌絲霉素NZ2114組成型表達菌株中試發(fā)酵產(chǎn)物的檢測

取發(fā)酵液離心的上清，經(jīng)XCell SureLock?Mini-Cell蛋白垂直電泳系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶（見圖6），與菌絲霉素NZ2114蛋白的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴散法測定甲醇誘導菌絲霉素NZ2114蛋白的抗菌活性結(jié)果也顯示（見圖7），重組轉(zhuǎn)化子甲醇誘導發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有明顯的抑制作用。

圖6 不同時間段畢赤酵母重組表達菌絲霉素的Tricine-SDS-PAGE分析

圖7 誘導畢赤酵母重組表達菌絲霉素的發(fā)酵液抑菌活性

50 L發(fā)酵罐誘導96 h獲取發(fā)酵液上清，將上清用微孔濾膜過濾，加入受試菌中，并使終濃度稀釋為1 200、1 500、2 000倍。然后置于37℃條件下，培養(yǎng)12 h?？瞻讓φ諡槲醇影l(fā)酵液和氨芐青霉素。陽性對照為氨芐青霉素(100 μg/ml)。結(jié)果顯示：氨芐青霉素對金黃色葡萄球菌CMCC26003的MIC為0.028 6 μg/ml，菌絲霉素發(fā)酵液誘導96 h對金黃色葡萄球菌CMCC26003的MIC等效于氨芐青霉素0.012 3～0.016 3 μg/ml。

圖8 誘導96 h時畢赤酵母重組表達菌絲霉素發(fā)酵液的MIC

3 討論

目前，全球抗生素濫用情況日益嚴重，導致越來越多傳統(tǒng)抗生素耐藥致病菌株的產(chǎn)生，使人們重新審視抗生素的定位和作用。越來越多的國家對抗生素在農(nóng)產(chǎn)品中的添加予以限制和禁止，因此，迫切需要開發(fā)能夠取代傳統(tǒng)抗生素的新型添加劑[5]。防御素具有獨特的抗菌機理、不易產(chǎn)生耐藥性和殺菌高效性的優(yōu)勢，并且具有多靶向性和多作用途徑的免疫保護促進作用，有望成為新一代的抗感染藥物，具有廣闊的發(fā)展前景[2]。

體外實驗研究報道[6]，菌絲霉素對G-和真菌抑菌效果不理想，而對G+的幾個種類（包括鏈球菌屬、葡萄狀球菌屬、腸球菌屬、棒狀桿菌屬和桿狀菌屬）具有殺傷作用，尤其是菌絲霉素對肺炎鏈球菌（S.pneumoniae）的MIC僅為0.125 mg/l[2]，與萬古霉素和青霉素的殺菌速率相當[7]。菌絲霉素具有良好的鹽離子耐受能力，在生理鹽離子濃度下同樣具有殺菌活性。此外，它還具有良好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，在pH值2.0～10.0范圍內(nèi)，菌絲霉素對金黃色葡萄球菌均有抑菌活性；100℃熱處理1 h后，亦能抵抗木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的降解[8]。此外，菌絲霉素對鼠類L929成纖維細胞、正常的人角質(zhì)化表皮細胞（NHEK）、肺成纖維細胞和人支氣管上皮細胞都沒有細胞毒性，對人血紅細胞、兔血紅細胞也沒有溶血性[6]。

研究開發(fā)防御素的主要任務(wù)是尋求低成本且獲得大量高活性抗菌肽的工藝。天然提取的防御素非常有限，化學合成成本高，且其分子中含有3～4對二硫鍵，化學合成也比較困難，不足以滿足臨床需要。通過基因工程表達技術(shù)以其低成本、重組肽活性高和可以對基因進行改造等優(yōu)勢，在防御素表達中得到迅速發(fā)展和應(yīng)用。畢赤酵母表達系統(tǒng)是真核表達系統(tǒng)，已有多種外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中成功表達并得以應(yīng)用。它具有完備的基因表達調(diào)控機制、蛋白質(zhì)加工修飾及分泌能力，而且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素[9]。此方法獲得的菌絲霉素方便快捷，不會因內(nèi)毒素而導致動物機體中毒和腹瀉；同時，組成型區(qū)別于甲醇誘導型的酵母表達方式，培養(yǎng)簡單，無需更換碳源，也可以避免揮發(fā)性的毒性物質(zhì)甲醇污染動物機體和環(huán)境[5]。

4 結(jié)語

本研究基于菌絲霉素具有良好的穩(wěn)定性，通過畢赤酵母表達系統(tǒng)表達菌絲霉素NZ2114基因，通過信號肽將其分泌到細胞外，并進行了50 L發(fā)酵罐的中試研究。結(jié)果顯示：菌體濕重后期增長緩慢，其主要原因是菌絲霉素NZ2114在表達的過程中，隨著菌絲霉素NZ2114蛋白濃度不斷上升，其表現(xiàn)出對酵母宿主菌的毒性作用，當表達的菌絲霉素NZ2114蛋白濃度達到一定濃度后，宿主菌停止生長，菌絲霉素NZ2114表達進入平臺期后結(jié)束發(fā)酵；菌絲霉素NZ2114發(fā)酵液稀釋1 500～2 000倍對金黃色葡萄球菌CMCC26003具有抑制作用；該發(fā)酵周期短，培養(yǎng)簡單方便，成本低。后期主要提高菌絲霉素NZ2114基因工程菌的生物量及其表達量，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比，進一步降低生產(chǎn)成本，為日后的規(guī)?；笊a(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；同時促進抗菌肽菌絲霉素在獸藥、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥、生物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動植物抗病基因工程方面等領(lǐng)域上的發(fā)展。