■王 津 馬 蕊 韓 燁郭曉倩周志江鄭成江范 寰

（1.天津大學，天津300072；2.天津師范大學生命科學學院，天津 300384；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300384）

近年來研究發(fā)現(xiàn)，由于抗生素過量和不合理的使用導致動物體內(nèi)藥物殘留、細菌的耐藥性不斷增強等問題，給畜禽業(yè)及人類健康造成嚴重危害?？股仉m可以抑制病原菌，但對動物體內(nèi)的益生菌有抑制作用，從而破壞了動物腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。尋找新的替代品以取代抗生素在動物防病及促生長方面的作用，以減少甚至取代抗生素的應(yīng)用是目前的研究熱點。

益生素又被稱為微生態(tài)制劑，是一類能夠維持腸內(nèi)菌群生態(tài)平衡，對機體起有益作用的活的微生物制劑。它可直接通過增強動物對腸內(nèi)有害微生物的抑制作用或通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，從而促進動物生長或提高飼料轉(zhuǎn)化率。國內(nèi)外許多研究表明，微生態(tài)制劑對平衡動物腸道菌群和改善腸道微生態(tài)、環(huán)境等方面具有十分重要的作用，對家禽消化道疾?。ㄈ缟抽T氏菌、大腸桿菌等細菌性疾病）均有十分顯著的防治作用。

微生態(tài)制劑用于提高動物生產(chǎn)性能和健康水平，效果差異較大，原因之一就是菌株定植的宿主特異性。因此，理想的微生態(tài)制劑菌株最好來自于同源動物的腸道，只有這樣才能增強益生菌功效。本研究目的是從肉雞盲腸內(nèi)分離出芽孢桿菌，并圍繞菌株的形態(tài)、抑菌性能、耐酸性和耐膽鹽性等幾個方面進行了益生菌株的篩選，為今后開發(fā)安全、有效的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)芽孢桿菌，配方如下：蛋白胨1 g、牛肉膏0.3 g、氯化鈉0.5 g、蒸餾水100 ml，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)抑菌試驗中的指示菌大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌，配方如下：大豆蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、氯化鈉1 g、蒸餾水100 ml，pH值7.0。

1.2 指示菌

大腸桿菌（Escherichia coli）和雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）由天津市畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.3 芽孢桿菌的分離

用75%酒精消毒雞體表面，剪斷氣管和頸動脈，使雞迅速死亡。然后用干凈的載玻片刮取盲腸內(nèi)容物樣品0.5 g，添加到裝有4.5 ml無菌生理鹽水的試管中，用渦旋式混勻器使其充分混合均勻。將此原液放于100℃水浴鍋中加熱10 min殺死非芽孢的微生物，之后將該原液加入到45 ml NB液體培養(yǎng)基中，37℃富集培養(yǎng)20 h。取富集培養(yǎng)后的菌液500 μl到4.5 ml無菌生理鹽水中進行梯度稀釋，依次梯度稀釋至 10-6。分別取 10-4、10-5、10-6稀釋度的樣品100 μl，滴到NB瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布棒將其涂布均勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，挑取5株單菌落，反復劃線純化到獲得純菌株為止。將純化好的菌落進行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色和鏡檢。

1.4 抑菌試驗

采用牛津杯法對篩選出的芽孢桿菌菌株進行抑菌活性測定。將指示菌大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌按1%（v/v）接種量分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。將芽孢桿菌菌株發(fā)酵液以1%（v/v）接種量接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18 h備用。取滅菌培養(yǎng)皿，注入滅菌的NB固體培養(yǎng)基15 ml，水平放置使之凝固，作為底層。放入已滅菌的牛津杯，將含有200 μl指示菌的20 ml的LB半固體培養(yǎng)基混勻倒入平板，冷凝后取出牛津杯。在孔中加入50 μl芽孢桿菌菌液，放置在4℃擴散4 h，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑，每個處理三個重復試驗。

1.5 耐酸和耐膽鹽試驗

參見王津等（2014）的方法。

1.6 16S rDNA鑒定

1.6.1 細菌DNA的制備和擴增

將篩選出的芽孢桿菌接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1.5 ml培養(yǎng)液于離心管中，12 000 r/min離心30 s，棄上清，收集菌體進行DNA的制備和PCR擴增。

1.6.2 擴增產(chǎn)物的電泳分析

以1倍TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠。取PCR擴增產(chǎn)物5 μl，加入溴酚藍指示劑，混勻后加樣。100 V電泳30 min，溴化乙錠染色20 min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.6.3 測序及序列比對

擴增出鑒定細菌的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行純化和測序后做 Blast分析，并在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中比對，獲得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

試驗共分離了5株疑似芽孢桿菌菌株，分別標記B1、B2、B3、B4、B5。疑似芽孢桿菌的單菌落呈圓形，直徑4～5 mm，乳白色，表明呈褶皺狀，邊緣為鋸齒狀，質(zhì)地黏稠，革蘭氏染色均為陽性，桿狀。

2.2 抑菌試驗

菌株對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌的抑制作用結(jié)果見表1。由抑菌試驗結(jié)果可以看出，所篩選的菌株均對大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌有一定的抑制作用。對大腸桿菌抑菌圈直徑在10.77～16.99 mm，而對雞白痢沙門氏菌抑菌圈直徑在11.24～17.36 mm。挑選出對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌抑菌圈直徑均超過15.00 mm的菌株，分別為B3、B4、B5，進行下一步的耐酸試驗。

表1 菌株對大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌的抑制作用

2.3 耐酸試驗

雞胃中pH值很低，一般為2.0～3.0。因此益生菌必須具有較強的耐酸能力，才能通過高酸性的胃環(huán)境而達到腸道發(fā)揮作用。本試驗考察2 h內(nèi)不同pH值條件下B3、B4、B5菌株的存活率，結(jié)果見表2。除了B3外，B4、B5菌株均表現(xiàn)出了較強的耐酸能力。pH值4.0處理后存活率分別為63.42%和87.01%；pH值3.0處理后存活率分別為41.34%和59.99%；pH值2.0處理后存活率分別為30.22%和40.02%。因此，挑選出B4、B5進行下一步的耐膽鹽試驗。

表2 不同pH值條件下菌株的存活率（%）

2.4 耐膽鹽試驗

小腸內(nèi)膽鹽濃度在0.1%～0.3%。因此，益生菌必須具有較強的耐膽鹽能力，才能通過小腸內(nèi)膽鹽的高滲透壓環(huán)境。本試驗2 h內(nèi)不同膽鹽濃度條件下B4、B5菌株的存活率，結(jié)果見表3。B5表現(xiàn)出了較強的耐膽鹽能力，0.1%處理后存活率為82.34%，0.2%處理后存活率為70.18%，0.3%處理后存活率為48.77%。因此，將菌株B5進行16S rDNA鑒定。

表3 不同膽鹽濃度條件下菌株的存活率（%）

2.5 16S rDNA鑒定

分離菌株基因組DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測（見圖1）。由圖1可知，分離的芽孢桿菌菌株得到一條清晰的條帶，與Marker相比，所獲得的擴增片段大小在1 500 bp左右，說明所得PCR產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，可以純化后進行測序。將菌株的16S rDNA序列輸入到GenBank中，尋找與其同源性最高的菌株。菌株B5與Bacillus amyloliquefaciens的16S rDNA序列的同源性達到了99%。最終確定菌株B5為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法是從菌落觀察及一系列復雜的生理生化試驗來判斷，具有耗時長、易干擾、誤差大等缺點。而分子生物學鑒定技術(shù)從基因水平對菌株進行鑒定，具有精確、快速的優(yōu)點。本試驗從盲腸篩選出一株芽孢桿菌菌株，進行16S rDNA鑒定，經(jīng)同源性比較分析確定為解淀粉芽孢桿菌，同源性達到99%。

益生菌作為微生態(tài)類的飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用已經(jīng)越來越普通。然而，其理論上的種種優(yōu)越性能在生產(chǎn)上表現(xiàn)的效果卻常常不盡如人意，究其原因，與益生菌菌株的來源有很大的關(guān)系。大量研究指出，采用與原宿主、原生態(tài)環(huán)境和原微生態(tài)系統(tǒng)相適應(yīng)的同源動物腸道菌群作為益生菌菌株是最為理想的。芽孢桿菌利用氧氣的能力很強，它們在腸道定植后，能大大消耗腸道內(nèi)的氧氣，造成厭氧環(huán)境，使得腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群——厭氧菌大量繁殖。芽孢桿菌能形成特殊的休眠體芽孢，在飼料加工過程及進入動物消化道經(jīng)受各種不利因素的影響方面，具有比乳酸菌更強的抗逆性和耐受性，而且營養(yǎng)要求也很簡單，具有明顯的生產(chǎn)優(yōu)勢。因此，本試驗以雞的盲腸作為來源，進行芽孢桿菌菌株的分離、篩選和鑒定。

微生態(tài)學理論認為，要保證經(jīng)口服方法飼喂的益生菌能夠?qū)游锂a(chǎn)生各種益生效應(yīng)（增強免疫力、預防腹瀉、拮抗病原微生物等），先決條件是益生菌能夠在經(jīng)過胃部到達消化道后段時還保持著較多的活菌數(shù)。因此，益生菌必須具備耐受胃中的低pH值，才可能進入動物消化道后能夠存活、繁殖，發(fā)揮其益生作用。經(jīng)過了胃部的極端酸性環(huán)境之后，益生菌還需要耐受小腸中膽汁形成的高滲透壓環(huán)境。本試驗篩選出的B5菌株有較強的耐酸和耐膽鹽能力。而芽孢桿菌在較低pH值環(huán)境下仍能正常萌發(fā)和生長繁殖，原因可能是在酸性環(huán)境中，芽孢桿菌通過調(diào)節(jié)自身膜壁的滲透壓，阻止氫離子進入細胞；或當氫離子進入細胞后，用鈉氫泵反向協(xié)助運輸將氫離子排出，使細胞內(nèi)pH值保持中性。

4 結(jié)論

試驗通過抑菌、耐酸、耐膽鹽試驗，從肉雞盲腸中篩選出了1株芽孢桿菌菌株。經(jīng)16S rDNA序列同源性比較分析，最終鑒定為解淀粉芽孢桿菌，為今后研究與開發(fā)益生菌劑奠定了理論基礎(chǔ)。

（參考文獻14篇，刊略，需者可函索）