吳柳松 錢民章 (貴州省遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563004)

1 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)簡介

Seidah等〔1〕在研究神經(jīng)元發(fā)育分化時發(fā)現(xiàn)一個新基因，稱為PCSK9，該基因編碼是一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，名為神經(jīng)細胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(NARC)-1，該酶參與肝細胞發(fā)育再生和神經(jīng)細胞分化〔1〕。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9蛋白能靶向降解低密度脂蛋白(LDL)受體(LDLR)，與脂質(zhì)代謝、異常膽固醇血癥及動脈粥樣硬化等有密切關(guān)系。

人PCSK9基因位于染色體1p32.3，全長29 kb，含12個外顯子，編碼區(qū)約為2 kb，cDNA序列具有3 617 bp，編碼的NARC-1為692個氨基酸殘基的前體蛋白，是一種新的分泌型絲氨酸蛋白酶，屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族(PC)。其氨基酸全序列可分為信號肽(SP 1～30)、前結(jié)構(gòu)域(prodomain，31～152)、催化結(jié)構(gòu)域(Catalytic domain，153～452)、羧基末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal，526 ～ 692)〔1〕。PCSK9 基因啟動子區(qū)域含有保守的Sp1和體內(nèi)固醇調(diào)節(jié)元件(SRE)位點。PCSK9蛋白合成分泌時，首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成一個 PCSK9酶原(apo-PCSK9，74 kD)，可溶性酶原在151～152殘基處發(fā)生自動催化分裂，釋放N末端前導(dǎo)區(qū)域，并結(jié)合至催化區(qū)域，前片段分裂之后，成熟的 PCSK9(60 kD)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并被分泌進入血液〔2，3〕。

PCSK9主要在肝臟和腸道表達，在腎臟、皮膚、脾臟、腦、神經(jīng)系統(tǒng)及血管平滑肌等組織中也有少量表達，在神經(jīng)上皮瘤SK-N-MCIXC，結(jié)腸癌 LoVo-C5，人肝癌 HepG2，肝 BRL-3A，胰島TC3，淋巴白血病Rin-m5F和Schwann細胞系中均有高表達。目前已證實，體內(nèi)SRE結(jié)合蛋白(SREBP)-1a、-1c和-2均可上調(diào)PCSK9的表達〔4，5〕。肝X受體(LXR)激動劑和胰島素也可上調(diào)PCSK9的表達，且胰島素和LXR的激動劑上調(diào)PCSK9表達均是通過SREBP-1c介導(dǎo)的〔4〕。研究還發(fā)現(xiàn)，他汀類降脂藥也可上調(diào)PCSK9的表達〔6〕，PCSK9的表達還與年齡、性別以及其他多種機制代謝程度密切相關(guān)〔7〕。

2 PCSK9與LDLR

大量研究表明，PCSK9可通過靶向降解細胞表面的LDLR來減少肝攝取LDL，使血漿LDL清除減少和LDL膽固醇(LDLC)升高，從而影響體內(nèi)脂類代謝調(diào)節(jié)。

研究發(fā)現(xiàn)，用腺病毒介導(dǎo)PCSK9在野生型鼠中過表達，鼠肝中LDLR顯著減少，血漿LDL水平升高;在PCSK9的一些突變體內(nèi)也可觀察到同樣結(jié)果〔8〕。另外，在培養(yǎng)的肝細胞中過表達PCSK9，細胞表面LDLR水平和活性明顯降低。然而，在PCSK9敲除的肝癌細胞中，LDLR水平和活性升高〔9〕。在PCSK9缺陷的鼠肝中，同樣檢測到LDLR水平和活性明顯升高。另有研究進一步證實，在C57BL/6鼠內(nèi)，PCSK9可明顯抑制肝臟LDLR的表達，減少LDL肝攝取，從而使血漿LDL水平顯著升高〔10〕。

PCSK9是通過阻斷LDLR從內(nèi)涵體到細胞表面再循環(huán)從而介導(dǎo)其降解。首先，PCSK9與細胞表面LDLR結(jié)合形成復(fù)合物，結(jié)合時，二者構(gòu)象發(fā)生特殊改變，以促進復(fù)合物轉(zhuǎn)載LDLR和PCSK9循環(huán)再利用。隨后，復(fù)合物進入內(nèi)涵體，內(nèi)涵體酸性環(huán)境使PCSK9與LDLR親和力增加150倍，二者結(jié)合更為緊密。最后，復(fù)合物將LDLR送入溶酶體降解，PCSK9從復(fù)合物中分離并重新利用。研究表明，PCSK9介導(dǎo)LDLR降解可能同時受到血漿LDL、極低密度脂蛋白(VLDL)及某些特殊組織因子調(diào)節(jié)〔11〕，且PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解并不受蛋白酶抑制劑、門冬氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的影響〔12〕。PCSK9對LDLR的降解僅僅發(fā)生在蛋白水平，在PCSK9基因敲除后的小鼠，其血漿膽固醇水平比野生型小鼠顯著下降，而其肝臟 LDLR蛋白表達明顯增加，但相應(yīng)的mRNA表達卻沒有變化〔13〕。

他汀類降脂藥可上調(diào)PCSK9基因表達，影響其降脂效果。在PCSK9基因敲除鼠中，使用他汀類藥時，其LDLR的量明顯高于野生型鼠，血脂對降脂藥的敏感性增高〔14〕。

Chan等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9的抗體 mAbl與 PCSK9結(jié)合后抑制PCSK9與LDLR的結(jié)合，減少其對LDLR的降解，可降低LDL-C水平。在野生型小鼠中，mAbl可以升高LDLR水平2倍，同時可以降低血清總膽固醇36%，而在LDLR-/-小鼠中卻沒有觀察到這些效應(yīng)。當(dāng)mAbl與他汀類藥物聯(lián)用時，可提高他汀類藥物的降脂效果。因此，PCSK9拮抗劑為降低LDL-C提供了新的策略〔16〕。目前，一些新的 PCSK9單克隆抗體如AMG145、RN316等正在被試驗于臨床實驗。雖然這些抗體目前仍處于臨床研發(fā)初期，但結(jié)果已經(jīng)開始讓人興奮，因為這些抗體降低LDL效果顯著，似乎可以成為他汀類藥物的添加劑，希望其可以使絕大多數(shù)患者達到LDL的控制目標。

這些研究表明，PCSK9能夠調(diào)節(jié)肝臟LDLR蛋白的數(shù)量，影響LDLR介導(dǎo)的LDL的攝取，從而影響膽固醇的水平，并提示PCSK9抑制物與他汀類藥在提高LDLR和減少血漿膽固醇方面具有協(xié)同作用。這將為靶向PCSK9的新藥研發(fā)提供新的思路。

3 PCSK9突變與血清膽固醇水平

PCSK9有多種序列變異，涉及許多生理及病理過程。PCSK9不同的突變類型，對血漿膽固醇水平有不同的調(diào)節(jié)作用。PCSK9突變形式按PCSK9調(diào)節(jié)LDLC水平，可分為功能獲得型突變和功能缺失型突變兩類。

3.1 PCSK9功能缺失型突變與低膽固醇血癥 PCSK9功能缺失型突變可削弱或滅活PCSK9降解LDLR的能力，導(dǎo)致肝細胞LDLR的增多，血液中LDL被攝取降解增加，進而引起低膽固醇血癥。主要缺失型突變形式有G106R、A443T、R46L、Y142X、SR97、L253F、C679X 和 Q554E 等〔17〕。非洲人群中低膽固醇血癥均源于PCSK9突變，其突變率高于其他任何種族。

在對1 769例美籍非洲人構(gòu)成的低膽固醇血癥人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有33例與PCSK9的2個功能缺失型突變Y142X和C679X有關(guān)。這些突變個體膽固醇內(nèi)源性生物合成和腸吸收沒有變化，說明PCSK9功能喪失使LDLR表達和活性增加〔14〕。另外，PCSK9其他功能缺失型突變(如R46L)也可引起低膽固醇血癥，降低冠心病發(fā)病率。有調(diào)查顯示，與正?；蛐腿巳罕容^，PCSK9功能缺失型突變可使心血管類疾病發(fā)病率降低88%，而藥物治療僅能使其降低23%。他汀類藥的降脂效果在這類基因突變的個體上非常明顯，PCSK9基因的 R46L、G106R、N157K和R237W等突變型對他汀類藥治療的敏感性增加，并出現(xiàn)低膽固醇血癥〔18〕。

3.2 PCSK9功能獲得型突變與高膽固醇血癥 PCSK9功能獲得型突變可增強PCSK9降解LDLR的能力，從而使血漿LDLC顯著升高，導(dǎo)致常染色體顯性高膽固醇血癥(ADH)或家族性高膽固醇血癥(FH)。主要突變形式有 D129G、S127R、R496W、C(-161)T、R218S、1474V、F216L、D374Y、N425S、H553R和 E670G 等〔17〕。

研究發(fā)現(xiàn)，在ADH的患者中12.5%的人有PCSK9的突變。Abifadel等〔19〕對法國的23個ADH家系進行鑒定，在排除了LDLR及apoB的突變后的35例發(fā)病個體中，發(fā)現(xiàn)其中13例發(fā)病個體與PCSK9功能獲得型突變S127R有關(guān);另外22例個體則與PCSK9的另一功能獲得型突變F216L有關(guān)。由此可見PCSK9發(fā)生這兩種突變均可導(dǎo)致ADH。另外，在美國猶他州ADH家族發(fā)現(xiàn)D374Y突變;在日本發(fā)現(xiàn)了C(-161)T和1474V兩個突變〔20〕。在兩個突尼斯ADH家族發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)216L和E670G突變〔21〕，在有上述突變的人群當(dāng)中，LDL-C的水平均比普通人顯著提高。2005年，在美國發(fā)現(xiàn)PCSK9的E670G突變和LDLC水平及動脈粥樣硬化嚴重程度有關(guān)〔22〕，并因此建議E670G作為血漿高LDL-C水平的獨立預(yù)測因子。

研究表明，PCSK9功能獲得型突變導(dǎo)致高膽固醇血癥，可能是通過調(diào)節(jié)載脂蛋白(apo)B100的分泌及代謝而產(chǎn)生的。apoB100是LDLR的天然配體，負載LDL-C顆粒并與LDLR結(jié)合，轉(zhuǎn)運LDL-C進入肝細胞進行代謝。野生型小鼠的血漿PCSK9在不依賴LDLR的情況下，可顯著上調(diào)apoB100的表達〔8〕，而 PCSK9-/-小鼠的血漿 apoB100，apoE48水平卻明顯下降〔14〕。Ouguerram等〔23〕通過對2例攜帶PCSK9 S127R突變的ADH患者的研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9突變體S127R可引起apoB100表達增高。體內(nèi)試驗表明〔24〕，在有S127R突變患者中，血漿LDL升高，apoB100合成增多。在PCSK9過表達的小鼠模型和細胞中，PCSK9的存在并不能改變VLDL apoB的合成及分泌。然而S127R突變患者卻可導(dǎo)致VLDL apoB的升高。后續(xù)研究〔23〕還發(fā)現(xiàn)，PCSK9的S127R突變組中，apoB100明顯增高，而且升高的apoB100源于VLDL、IDL、LDL的生成過多。在D374Y突變引起的ADH患者與LDLR或apoB100突變引起的ADH患者相比，使用他汀類藥前后，膽固醇水平更高〔23〕。

4 PCSK9的其他功能

PCSK9除了可以影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝外，還涉及其他許多生物過程。譬如PCSK9可促進肝臟發(fā)育、再生、促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、影響神經(jīng)系統(tǒng)分化并且與糖尿病相關(guān)。PCSK9還可通過降解脂肪組織的VLDLR，限制內(nèi)臟的脂肪生成〔25〕。研究表明，PCSK9能夠降低鼠肝細胞表面丙型肝炎病毒的受體 CD81的表達，調(diào)節(jié)丙型肝炎病毒的感染〔26〕。研究還發(fā)現(xiàn)，PCSK9基因的過度表達導(dǎo)致包括細胞周期、細胞凋亡、炎癥和應(yīng)急反應(yīng)等多種途徑的失調(diào)〔27，28〕。而PCSK9基因缺失對腫瘤的轉(zhuǎn)移可起到一定的保護作用〔29〕。

5 展望

由于PCSK9可介導(dǎo)LDLR降解，升高LDL-C水平，增加高脂血癥及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的患病風(fēng)險，研發(fā)針對PCSK9的藥物，抑制PCSK9的表達或阻斷其降價LDLR的作用成為治療動脈粥樣硬化、ADH的新思路。比如:PCSK9合成分泌需自身催化反應(yīng)，采用自身催化特異敏感小分子抑制劑可抑制活性PCSK9生成;利用小分子抑制劑阻斷PCSK9、LDLR作用，干擾二者結(jié)合;運用反義技術(shù)可能抑制人體肝臟PCSK9功能;針對PCSK9、LDLR復(fù)合物的抗體療法等均是可考慮的策略。PCSK9與脂質(zhì)代謝更廣泛的聯(lián)系及其作用機制尚待深入研究。

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