張 穎 張向陽 陳玉嵐 歐陽菊艷 王 瑜 王 玲 王 紅

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院干部病房，新疆 烏魯木齊 830011)

原發(fā)性高血壓是多因素多基因疾病，目前發(fā)病機制仍未闡明。其中血漿同型半胱氨酸(Hcy)增高已被普遍認為是心血管疾病的危險因素，并且可能參與了高血壓的病理生理過程〔1〕。胱硫醚β-合成酶(CBS)是Hcy代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，其基因突變可導致CBS活性明顯降低，從而引起高同型半胱氨酸血癥。CBS T833C是其較常見的多態(tài)性位點，但近年來關(guān)于該位點研究主要集中于腦血管疾病領(lǐng)域〔2〕，而與高血壓的關(guān)系研究較少，與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓關(guān)系的研究鮮有報道。本研究通過新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓患者及同族血壓正常人群之間CBS T833C基因多態(tài)性分布的比較，探討CBST833C基因多態(tài)性與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 見表1。采用隨機整群抽樣的方法抽取定居在新疆塔城、伊犁、阿勒泰地區(qū)的哈薩克族人群，共納入對象245例，進行標準化問卷調(diào)查，體格檢查。各組受試者均無血緣關(guān)系，實驗符合國務院頒布的《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》第33條規(guī)定，所有研究對象均了解實驗目的和內(nèi)容，簽署知情同意書。其中高血壓組共145例，男109例，女36例。納入標準:高血壓符合2010年中國高血壓防治指南制訂的高血壓診斷標準〔3〕，收縮壓(SBP)≥140 mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg。排除標準:排除繼發(fā)性高血壓，嚴重心律失常、冠心病，合并肝、腎功能不全，心力衰竭，腦血管意外者，腫瘤，急、慢性傳染病，孕婦及哺乳期婦女的患者。對照組100例，男77例，女23例。納入標準:同一地區(qū)的血壓正常者，SBP＜140 mmHg和(或)DBP＜90 mmHg。排除標準:目前正在服降壓藥物且血壓正常者;合并心腦肝腎疾病及急慢性疾病等其他疾病患者。高血壓組與對照組受試者的性別與年齡匹配。高血壓組的吸煙比例、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、SBP、DBP、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及Hcy水平均明顯高于對照組(P＜0.05)。而飲酒比例、血尿酸(UA)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平兩組之間未見明顯差異(P＞0.05)。

表1 高血壓組與對照組一般臨床資料比較(s)

表1 高血壓組與對照組一般臨床資料比較(s)

項目 高血壓組(n=145)對照組(n=100)t/χ2 值 P值109/36 77/23 0.11 0.74年齡(歲)49.23±7.56 49.90±10.01 0.56 0.57吸煙〔n(%)〕 104(71.7)85(85)5.92 0.02飲酒〔n(%)〕 112(77.2)66(66)3.76 0.05 BMI(kg/m2)27.31±3.94 24.98±3.28 4.84 0.00 SBP(mmHg)161.18±23.62 120.92±11.85 15.72 0.00 DBP(mmHg)96.46±10.99 76.91±7.94 15.25 0.00 FPG(mmol/L)5.56±1.67 5.83±1.17 2.06 0.04 UA(mmol/L)294.69±59.20 282.27±34.87 1.88 0.06 TC(mmol/L)4.48±0.98 3.72±1.25 5.35 0.00 TG(mmol/L)3.38±1.54 2.69±1.53 3.50 0.01 HDL-C(mmol/L)1.21±0.33 1.19±0.24 0.04 0.97 LDL-C(mmol/L)2.73±0.65 2.10±0.58 7.85 0.00 Hcy(μmol/L)男/女(n)17.19±6.11 13.77±5.66 4.24 0.00

1.2方法

1.2.1血漿Hcy測定 清晨空腹采集外周靜脈血3 ml，置EDTA-Na抗凝管，60 min內(nèi)3 000 r/min離心10 min，分離血漿－80℃保存?zhèn)錅y。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)檢測，檢測儀為伯樂酶標儀550型。

1.2.2其他生化指標測定 采用全自動生化分析儀酶法測定血漿FPG、血清TC、TG、LDL-C、HDL-C及 UA水平。

1.2.3DNA提取及PCR擴增 采空腹血6 ml，EDTA抗凝。常規(guī)方法抽提基因組DNA，測定DNA含量和純度。CBS T833C基因引物由上海生物工程公司合成，引物序列參考相關(guān)文獻〔4〕。上游純合型(P1):5'GGAGAAGTGTCCTGGATGCA3'，下游野生型(P2):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAA3'，突變型(P3):5'CCCTTCGGGATCCACCCCAG3'。

PCR反應分兩管進行，首先于第一管中加入P1和P2各0.5 μl;于第2管中加入P1和P3各0.5 μl，然后分別在2管中依次加入 2 × PCR Master 10 μl，DNA 模板 1 μl，ddH2O 8 μl，PCR反應總體系為20 μl。反應條件:94℃預變性5 min，94℃變性60 s，60℃復性45 s，72℃延伸60 s，35 個循環(huán)后72℃延伸7 min，4℃終止反應。特異性 PCR擴增產(chǎn)物片段大小為867 bp，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學分析 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件行t檢驗及χ2檢驗，計算各組等位基因頻率，并按Hardy-Weinberg平衡法檢驗樣本的群體代表性。Logistic多元回歸法分析基因多態(tài)性及其危險因素對疾病表型的作用。

2結(jié)果

2.1新疆哈薩克族CBS T833C基因型鑒定 酶切后存在3種基因型，純合子TT顯示867 bp 1號一條帶而1'號沒有條帶，變異純合子CC基因型顯示867bp 2'號一條帶而2號沒有條帶，雜合子TC基因型顯示867 bp 3號及3'號兩條帶。見圖1。

圖1 CBS T833C基因多態(tài)性瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2新疆哈薩克族CBS T833C基因型及等位基因頻率進行定律檢驗 CBS T833C基因型TT、TC、CC分布頻率觀察值分別為49.80%(122例)、38.37%(94例)、11.83%(29例)，T等位基因頻率為68.98%，C等位基因頻率為31.02%。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(χ2=2.62，P=0.11)，達到遺傳平衡，在遺傳學上具有群體代表性，可代表新疆哈薩克族人群。

2.3兩組CBS T833C基因型與等位基因頻率比較 兩組研究對象在三種基因型分布及等位基因頻率之間相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 高血壓組與對照組CBS T833C多態(tài)性基因型及等位基因分布情況(n)

2.4哈薩克族CBS T833C不同基因型之間各臨床指標比較CBS T833C各基因型之間在BMI及TG有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。其中CBS 833CC型在BMI指標中高于其他兩型(P＜0.05)，CBS 833TC型在 TG指標中低于他兩型(P＜0.05)。Hcy在CBS T833C不同基因型水平，經(jīng)方差分析后差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 哈薩克族CBS T833C不同基因型各指標的比較(s)

表3 哈薩克族CBS T833C不同基因型各指標的比較(s)

25.58±3.39 26.73±4.12 28.19±4.07 6.85 0.00 SBP(mmHg)145.57±27.78144.62±28.60142.06±27.25 0.21 0.82 DBP(mmHg)88.43±13.35 89.14±14.40 86.88±13.83 0.33 0.72 FPG(mmol/L)5.65±0.88 5.80±1.21 5.79±0.76 0.66 0.51 UA(mmol/L)288.87±39.05295.29±67.09276.97±35.65 1.59 0.21 TC(mmol/L)4.02±1.20 4.32±1.16 4.29±0.95 1.97 0.14 TG(mmol/L)3.08±1.28 2.43±1.43 b 3.34±1.28 9.19 0.00 HDL-C(mmol/L)1.18±0.31 1.19±0.32 1.04±0.27 1.69 0.19 LDL-C(mmol/L)2.43±0.65 2.56±0.73 2.44±0.75 0.93 0.39 Hcy(μmol/L)BMI(kg/m2)16.31±6.70 15.36±5.73 15.82±6.32 0.32 0.72

2.5多元Logistic回歸分析 以高血壓分類為因變量，選擇年齡、性別、高血壓家族史、吸煙史、飲酒史、BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、Hcy、T833C多態(tài)位點的基因型為自變量進行高血壓危險因素回歸分析，BMI(OR=1.21，95%CI 1.11～1.33，P=0.00)，Hcy(OR=1.08，95%CI1.03～1.14，P=0.00)及高血壓家族史(OR=6.22，95%CI 3.31～11.68，P=0.00)是高血壓的獨立危險因素，CBS T833C多態(tài)位點基因型、年齡、吸煙史、飲酒史、FPG、TG、TC、LDL-C不是高血壓的獨立危險因素。

3討論

全國高血壓抽樣調(diào)查顯示新疆哈薩克族人群中高血壓的患病率居全國前列〔5〕。近年來關(guān)于哈薩克族高血壓的流行病學及遺傳學研究日益增多。Hcy是心腦血管疾病發(fā)生的獨立危險因素〔6〕，它可以造成血管內(nèi)皮損傷，血管平滑肌增生〔7，8〕。以往流行病學研究中發(fā)現(xiàn)我國人群Hcy水平偏高，高血壓患者則進一步升高〔9〕。本研究結(jié)果顯示新疆哈薩克族高血壓組患者的吸煙比例、BMI、SBP、DBP、TG、TC、FBG、LDL-C 及Hcy水平水平均明顯高于同族血壓正常對照組，說明對于該族高血壓人群也應重視心血管危險因素的控制。

Hcy是甲硫氨酸代謝過程中的中間產(chǎn)物。在人體內(nèi)Hcy的轉(zhuǎn)歸其中一條途徑就是在CBS的催化下，Hcy轉(zhuǎn)化成胱硫醚，是Hcy代謝途徑的主要限速酶之一。CBS基因定位于21q22.3，目前發(fā)現(xiàn)CBS的突變位點多達132個，最常見位點為T833C。Kozich等〔10〕發(fā)現(xiàn)CBS基因外顯子8中存在T833C突變，使得編碼的蘇氨酸被異亮氨酸替代，致CBS活性降低，從而造成Hcy在血中蓄積。本研究檢測到新疆哈薩克族人群CBS T833C的三個基因型，但其等位基因的頻率低于我國其他少數(shù)民族〔11〕。同時本研究對新疆哈薩克族高血壓組及正常對照的CBS T833C基因型與等位基因頻率進行比較，未發(fā)現(xiàn)兩組研究對象在三種基因型的分布頻率及等位基因頻率之間的差異。

目前CBS T833C位點突變主要集中于腦血管領(lǐng)域〔12，13〕。Ding等〔14〕一項關(guān)于CBS基因多態(tài)性與中國人缺血性腦卒中關(guān)系的Meta分析指出CBS T833C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病相關(guān)，同時攜帶C基因型是缺血性腦卒中的重要危險因素。而與高血壓關(guān)系的研究國內(nèi)尚無明確定論。呼日勒等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)CBS基因T833C位點與蒙古族高血壓病和高血壓合并腦梗死無關(guān)。本研究結(jié)果提示Hcy的代謝除與CBS的代謝途徑有關(guān)外，可能與年齡、TG、LDL基線水平及吸煙的差別有關(guān)。另外國內(nèi)關(guān)于原發(fā)性高血壓及同型半胱氨酸代謝基因多態(tài)性研究多集中在MTHFR C677T基因多態(tài)性，并且宗永華等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)高血壓人群中MTHFR基因 C677T純合突變可能是Hcy升高和H型高血壓的重要遺傳因素，而且存在性別差異。但既往有關(guān)新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓與Hcy代謝基因多態(tài)性的研究中均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性〔17～19〕。本次研究也未發(fā)現(xiàn)CBS T833C位點突變與新疆哈薩克族原發(fā)性高血壓有關(guān)，進一步說明Hcy代謝途徑較為復雜，參與的主要代謝酶之間也可能存在某種聯(lián)系。因此有關(guān)CBS基因變異與高血壓的關(guān)系有待進一步研究。

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