何敏恒，李秀英，曾令浩，黃景晟，郭新東*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣東廣州511447）

同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中泛酸含量

何敏恒，李秀英，曾令浩，黃景晟，郭新東*

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣州），廣東廣州511447）

建立了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)蜂蜜中泛酸（維生素B5）的快速定量和確證方法。樣品經(jīng)0.1%氨水（V/V）提取，MAX固相萃取柱凈化后，以0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，使用HSS T3色譜柱進(jìn)行分離，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。在優(yōu)化條件下，泛酸在0.500～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 6；方法檢出限為1.0 μg/kg（S/N=3），定量限為3.0 μg/kg（S/N=10）；回收率在98.3%～98.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%～3.1%。通過(guò)市售蜂蜜樣品測(cè)試表明，該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可用于蜂蜜中泛酸的快速檢測(cè)。

蜂蜜；泛酸；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；同位素稀釋

蜂蜜是主要的蜂產(chǎn)品，是人類最早的食物來(lái)源之一，目前幾乎每個(gè)國(guó)家都有生產(chǎn)。它的主要成分為果糖和葡萄糖[1]，此外還含有種類豐富的微量元素及多酚，黃酮，有機(jī)酸，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，呋喃醛和呋喃酸，氨基酸和蛋白質(zhì)，礦物質(zhì)和水溶性維生素。蜂蜜中微量元素的定性和定量的特征與其物理、化學(xué)及生物特性一樣，能夠成為追溯其植物來(lái)源和地理來(lái)源的一個(gè)有力的工具。因此，近年來(lái)對(duì)這些微量元素的檢測(cè)分析方法研究的發(fā)展吸引了越來(lái)越多的關(guān)注。

泛酸也稱維生素B5，是B族維生素的一種，是蜂蜜中一種常見(jiàn)的微量元素。泛酸是構(gòu)成輔酶A的重要成分，在維持細(xì)胞的代謝，維護(hù)頭發(fā)、血液、皮膚等的健康方面起著重要作用，泛酸缺乏可導(dǎo)致機(jī)體代謝混亂[2]。

目前泛酸的檢測(cè)方法有紫外分光光度法[3]，高效液相色譜法[4-7]，氣質(zhì)聯(lián)用法[8]，微生物法[9-11]，液質(zhì)聯(lián)用法[12-13]，生物傳感器法[14-15]，檢測(cè)對(duì)象多為乳粉和保健食品，由于紫外分光光度法、高效液相色譜法無(wú)法滿足確證要求；氣質(zhì)聯(lián)用法需要衍生，操作較繁瑣；微生物法步驟較多，分析時(shí)間較長(zhǎng)；生物傳感器法還處于研究階段，未能成為日常檢驗(yàn)的方法；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquidchromatographytandemmassspectrometry，UPLC-MS/ MS）采用保留時(shí)間與特征離子對(duì)比例對(duì)已知目標(biāo)物進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果的定性定量?jī)?yōu)勢(shì)明顯。本研究通過(guò)在樣品中添加同位素內(nèi)標(biāo)，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的蜂蜜中泛酸含量分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泛酸鈣（純度≥98.0%）：德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH公司；泛酸鈣-[13C6，15N2]（泛酸鈣同位素內(nèi)標(biāo)，純度≥99.5%）：美國(guó)IsoSciences公司；氨水（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；甲酸（色譜純）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6490超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；Acquity＠HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Waters Oasis MAX固相萃取柱（60 mg，3 mL）：美國(guó)Waters公司；BSA224S電子天平：德國(guó)Sartorius公司；MS3 basic渦旋振蕩儀：德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用超純水分別將泛酸鈣，泛酸鈣-[13C6，15N2]標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 μg/mL（以泛酸計(jì)）儲(chǔ)備液，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用超純水分別將泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，泛酸鈣-[13C6，15N2]標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至5.0 μg/mL，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用超純水將標(biāo)準(zhǔn)工作液分別配制成泛酸質(zhì)量濃度為0.500μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、40.0μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L，同位素內(nèi)標(biāo)（泛酸鈣-[13C6，15N2]）質(zhì)量濃度為100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理方法

樣品提?。悍Q取2.5 g蜂蜜（準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于10 mL比色管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，加入5 mL 0.1%氨水溶液（V/V），渦旋充分溶解，用0.1%氨水溶液（V/V）定容至10 mL，渦旋提取2 min，待凈化。

樣品凈化：取2 mL待凈化液至Waters Oasis MAX小柱中（預(yù)先用5 mL甲醇，5 mL 0.1%氨水溶液（V/V）活化），依次用6 mL水、6 mL甲醇淋洗，棄去流出液，最后用3 mL 2%甲酸甲醇（V/V）洗脫，收集洗脫液，50℃水浴中氮吹濃縮至近干，用超純水定容至1 mL，渦旋振蕩溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后供UPLC-MS/MS測(cè)定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱Waters HSS T3柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流速0.45 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A 0.1%甲酸溶液（V/V）；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈（V/V）；梯度洗脫：0～2.2 min，92%～80%A；2.2～2.4 min，80%～50%A；2.4～4.0 min，50%A；4.0～4.1 min，50%～92%A；4.1～7.0 min，92%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；毛細(xì)管電壓1.5 kV；離子源氣溫150℃；鞘氣流量（氮?dú)猓?1 L/min；鞘氣溫度250℃；毛細(xì)管電壓3 000 V。泛酸及泛酸同位素內(nèi)標(biāo)的定量和定性離子對(duì)、碰撞池加速電壓、碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 固相萃取柱的選擇

蜂蜜成分復(fù)雜，其中糖類物質(zhì)占60%以上，此外還有花粉、色素、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。在質(zhì)譜分析中，為了減少基質(zhì)效應(yīng)，樣品前處理時(shí)需要盡量去除這些雜質(zhì)，否則不僅會(huì)影響泛酸分析的準(zhǔn)確性，還會(huì)影響質(zhì)譜儀的壽命。固相萃取是一種有效從復(fù)雜基質(zhì)中提取目標(biāo)分析物，減少基質(zhì)效應(yīng)的凈化手段。本實(shí)驗(yàn)比較了Waters Oasis C18（60 mg，3 mL）、WatersOasisHLB（60mg，3mL）、WatersOasisMAX（60mg，3 mL）三種固相萃取柱對(duì)蜂蜜中泛酸的凈化效果，結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)對(duì)上樣流出液、淋洗液和洗脫液的分析，Waters Oasis HLB對(duì)泛酸的保留性不強(qiáng)，在上樣的過(guò)程中就有部分的泛酸流出；Waters Oasis C18對(duì)泛酸的保留性較強(qiáng)，但在淋洗過(guò)程中仍有少量泛酸被洗脫；Waters Oasis MAX的效果最好，Waters Oasis MAX是陰離子型固相萃取柱，由于泛酸的酸度系數(shù)（pKa）值為4.41[16]，而糖類物質(zhì)的pKa值在12～14之間，通過(guò)調(diào)節(jié)上樣液的pH值，可使泛酸選擇性吸附在固相萃取柱上，并將糖類物質(zhì)通過(guò)淋洗去除。經(jīng)凈化后，在色譜圖上未發(fā)現(xiàn)明顯的雜峰，由表2可知，泛酸的回收率為95.3%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.3%～7.1%，因此選擇Waters Oasis MAX進(jìn)行凈化。

2.1.2 提取液的選擇

蜂蜜中含有有機(jī)酸，因此蜂蜜的水溶液呈酸性，泛酸的pKa值為4.41，使用Waters Oasis MAX固相萃取柱要求上樣溶液的pH值比泛酸的pKa值大2個(gè)單位，因此需要調(diào)節(jié)蜂蜜溶液的pH值，使其大于6.41?？疾炝朔涿墼诩兯?、0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%氨水溶液（V/V）作為提取液時(shí)的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，用純水提取時(shí)，回收率為62.3%，而提取液中氨水體積分?jǐn)?shù)≥0.1%時(shí)，溶液的pH值均＞9.5，回收率均≥97.5%，因此選擇0.1%氨水作為提取液。

2.1.3 固相萃取上樣體積的優(yōu)化

固相萃取柱隨著上樣體積的增加，會(huì)出現(xiàn)過(guò)載的現(xiàn)象，從而影響回收率。分別取的待凈化液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL進(jìn)行測(cè)試，考察蜂蜜在Waters Oasis MAX（60 mg，3 mL）柱上的最優(yōu)上樣體積，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，固相萃取柱在上樣體積＞2.0 mL時(shí)過(guò)載，而上樣體積越大，方法的檢出限越低，因此上樣體積選擇2.0 mL。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

泛酸的極性較強(qiáng)，難以在常規(guī)的C18色譜柱上保留。本實(shí)驗(yàn)選用了對(duì)極性化合物有較強(qiáng)保留的Waters HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，泛酸在Waters HSS T3色譜柱上有較好的保留，且峰型對(duì)稱，峰寬為0.3 min。在正離子模式下，在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸有利于泛酸形成[M+H]+分子離子峰，還可以維持流動(dòng)相在梯度變化時(shí)流動(dòng)相體系的pH平衡。

2.3 方法的驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

在優(yōu)化條件下，對(duì)泛酸的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（含有100 μg/L同位素內(nèi)標(biāo)）進(jìn)行檢測(cè)，記錄定量離子峰面積（A）和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積（Ai），以A和Ai的比值（y）對(duì)泛酸質(zhì)量濃度（x，μg/L）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

對(duì)泛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸分析，由圖3可知，泛酸在0.500～500 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=0.031 9x-0.055 9，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6。根據(jù)儀器的檢出限及定量限，計(jì)算得到方法檢出限（定量離子S/N=3）和方法定量限（定量離子S/N=10）分別為1.0 μg/kg和3.0 μg/kg。

2.3.2 方法回收率和精密度

取蜂蜜樣品，分別添加40.0μg/kg、80.0μg/kg、160.0μg/kg 3個(gè)水平的泛酸，按1.3的方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次。泛酸的回收率和精密度見(jiàn)表4。由表4可知，3個(gè)添加水平的平均加標(biāo)回收率為98.3%～98.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～3.1%。結(jié)果表明，在3個(gè)加標(biāo)水平下，泛酸檢測(cè)準(zhǔn)確度、精密度良好，可以滿足蜂蜜中泛酸檢測(cè)的要求。

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

使用本方法檢測(cè)了10個(gè)市售蜂蜜樣品的泛酸含量，結(jié)果表明10個(gè)樣品均檢出泛酸，含量為84.1～361.0 μg/kg。目前現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)GB/T 22246—2008《保健食品中泛酸鈣的測(cè)定》檢出限為2 000 μg/kg，GB/T 5009.210—2008《食品中泛酸的測(cè)定》檢出限為2 500 μg/kg，靈敏度均無(wú)法滿足蜂蜜中泛酸檢測(cè)的要求，本方法的檢出限和定量限分別為1.0μg/kg和3.0μg/kg，可滿足蜂蜜中泛酸含量檢測(cè)的要求。

3 結(jié)論

本研究建立了使用同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蜂蜜中泛酸的快速檢測(cè)及確證方法。本方法利用0.1%氨水進(jìn)行提取，Waters Oasis MAX固相萃取柱凈化，Waters HSS T3色譜柱分離，多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。對(duì)比現(xiàn)行國(guó)標(biāo)泛酸檢測(cè)方法，本方法靈敏度高，定性定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，可以用于蜂蜜中泛酸含量的檢測(cè)。

[1]賓冬梅.蜂蜜的生理功能及開(kāi)發(fā)利用[J].特產(chǎn)研究，2004，26（1）：57-61.

[2]楊延輝，肖春玲.泛酸的功能和生物合成[J].生命的化學(xué)，2008，28（4）：448-452.

[3]彭愛(ài)紅，鄧清蓮，呂禹澤.茜素荷移分光光度法測(cè)定泛酸鈣[J].分析化學(xué)，2005，33（6）：897.

[4]那海秋，高廣慧，趙飛，等.高效液相色譜法測(cè)定多維元素片中泛酸的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29（2）：145-147.

[5]CIULU M,SOLINAS S,FLORIS I,et al.RP-HPLC determination of water-soluble vitamins in honey[J].Talanta,2011,83(3):924-929.

[6]農(nóng)云軍，王飛，竇文淵，等.高效液相色譜法測(cè)定嬰兒奶粉中維生素B12[J].中國(guó)釀造，2013，32（9）：142-144.

[7]盛靈慧，趙正宜，王晶，等.液相色譜法測(cè)定多元維生素片中4種水溶性維生素[J].化學(xué)分析計(jì)量，2010，19（1）：30-32.

[8]BANNO K,HORIMOTO S,MATSUOKA M.Analytical studies on the chiral separation and simultaneous determination of pantothenic acid and hopantenic acid enantiomers in rat plasma by gas chromatography-mass fragmentography[J].J Chromatogr B,1991,564(1):1-10.

[9]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 5413.17—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中泛酸的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[10]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009. 210—2008食品中泛酸的測(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[11]張艷，霍勝楠，胡明燕，等.嬰幼兒乳粉中泛酸測(cè)定的不確定度研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2014（9）：92-95.

[12]ANDRIEUX P,FONTANNAZ P,KILINC T,et al.Pantothenic acid(vitamin B5)in fortified foods:comparison of a novel ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method and a microbiological assay(AOAC official method SM 992.07)[J].J AOAC Int, 2012,95(1):143-148.

[13]陳稚，揭新明，蔡康榮.高效液相色譜與電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定嬰兒配方奶粉中的?；撬岷途S生素[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，25（3）：252-254.

[14]HAUGHEY S A,ELLIOTT C T,OPLATOWSKA M,et al.Production of a monoclonal antibody and its application in an optical biosensor based assay for the quantitative measurement of pantothenic acid(vitamin B5)in foodstuffs[J].Food Chem,2012,134(1):540-545.

[15]AHMADALINEZHAD A,CHEN A.Nanomedical device and systems design:challenges,possibilities,visions[M].Boca Raton:CRC Press, 2013.

[16]DE LEENHEER A P,LAMBERT W.Modern chromatographic analysis of vitamins[M].3rd ed.Boca Raton:CRC Press,2000.

HE Minheng,LI Xiuying,ZENG Linghao,HUANG Jingsheng,GUO Xindong*
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food(Guangzhou),Guangzhou 511447,China)

A method for rapid quantification of pantothenic acid(PA)in honey by isotope dilution-ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was developed.The sample was extracted by 0.1%ammonia water(V/V),cleaned-up on Oasis MAX solid-phase extraction column,and finally separated by UPLC using a HSS T3 column,employing acetonitrile with 0.1%formic acid-0.1%formic as the mobile phase for gradient elution.The results were determined by tandem mass spectrometry with multiple reactions monitoring mode and quantified by internal standard method.The result indicated that the linear range was 0.500-500 μg/L,with the correlation coefficients of 0.999 6,the limits of detection(LOD,S/N=3)was 1.0 μg/kg,limits of quantification(LOQ,S/N=10)was 3.0 μg/kg,and the recovery rate ranged from 98.3%to 98.7%with RSD of 2.4%-3.1%(n=6).The sample testing results showed that the method was simple and accurate,and suitable for the determination of PA in honey.

honey;pantothenic acid;UPLC-MS/MS;isotope dilution

O657.6

A

0254-5071（2015）04-0157-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.036

2015-03-20

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014QK052）

何敏恒（1984-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称芳笆称废嚓P(guān)產(chǎn)品分析技術(shù)。

*通訊作者：郭新東（1976-），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)樯V質(zhì)譜分析技術(shù)研究。