王勇，張錦玲，張立明，郭鵬，袁麗佳，劉大程*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵動力學模型的建立

王勇1，2，張錦玲1，2，張立明1，2，郭鵬1，2，袁麗佳1，劉大程1，2*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

對復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵動力學模型進行研究，并通過干重法確定發(fā)酵過程菌體生物量。采用Logistic方程，Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret/like方程進行最優(yōu)參數(shù)估計和非線性擬合，得到了描述發(fā)酵過程中菌體生長、β-葡聚糖和甘露聚糖合成、底物總糖消耗的動力學模型，通過對Luedeking-Piret模型的計算，可知β-葡聚糖和甘露聚糖合成與菌體合成是偶聯(lián)的。對試驗數(shù)據(jù)與模型預測值進行比較，發(fā)現(xiàn)平均相對誤差都小于10%，說明模型反映了復合酵母菌發(fā)酵過程的動力學特征，表明該動力學模型對指導生產(chǎn)具有實際意義。

復合酵母菌；固態(tài)發(fā)酵；β-葡聚糖；甘露聚糖；動力學模型

復合酵母培養(yǎng)物是一種含有少量活菌細胞、大量細胞代謝產(chǎn)物和發(fā)酵培養(yǎng)基組成的混合物，其核心價值在于它含有的發(fā)酵代謝物，主要分為營養(yǎng)代謝物（包括多糖、多肽、有機酸、氨基酸、酶類等）、增味劑和芳香物質、酶類及其他對促進畜禽生長有益的未知因子等。這些營養(yǎng)活性物質在調(diào)控瘤胃功能和提高反芻動物免疫功能方面發(fā)揮出積極的功效[1-2]。但在前期科研工作中也發(fā)現(xiàn)復合酵母菌培養(yǎng)物在固態(tài)發(fā)酵過程存在著缺陷：培養(yǎng)物中活性物質的產(chǎn)生規(guī)律及含量不清楚；發(fā)酵工藝多依靠技術工人的經(jīng)驗來控制，缺乏科學數(shù)據(jù)的支持；發(fā)酵結束后復合菌培養(yǎng)物質量的均一性較差，產(chǎn)品質量不穩(wěn)定。

近幾年，國內(nèi)學者對發(fā)酵動力學模型的研究較多。王二強等[3]對以甜高粱稈為基本原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程建立動力學模型，對指導乙醇固態(tài)發(fā)酵的放大和生產(chǎn)具有實際意義。魏培蓮等[4]對土曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他?。╨ovastatin）的過程進行了研究，建立了土曲霉固態(tài)發(fā)酵的動力學模型。固態(tài)發(fā)酵動力學研究主要集中在生產(chǎn)酒精及產(chǎn)纖維素酶兩個方面，以β-葡聚糖、甘露聚糖為產(chǎn)物建立動力學模型研究鮮見報道。菌體生長動力學模型建立時，多以測定菌體細胞組分含量為主（如葡萄糖胺[5]、核酸[5]和麥角固醇[5]），但這些方法通常較復雜，且發(fā)酵基質成分對結果也可能會產(chǎn)生干擾[6]。TEREBIZNIK M R等[8-10]通過測定發(fā)酵過程中發(fā)酵料干質量的變化建立了估算發(fā)酵不同階段菌體生物量的數(shù)學模型。

本研究建立的動力學模型以生產(chǎn)實際為基礎，通過測定發(fā)酵基質干質量的變化估算菌體生物量，建立菌體生成動力學模型，以β-葡聚糖、甘露聚糖為活性產(chǎn)物建立產(chǎn)物生成動力學模型，應用這些模型對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，對發(fā)酵過程進行預測及控制，為生產(chǎn)優(yōu)質綠色飼料添加劑提供有力的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）BC株、XR4株，均來源于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院反芻動物微生態(tài)制劑項目組菌種庫。

酵母菌活化培養(yǎng)基采用麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽膏粉130 g，氯霉素0.1 g。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基[11]：麩皮52.69%、玉米片20.45%、玉米粉16.07%、米糠4.09%、棉粕1.86%、豆粕3.99%和無機鹽0.85%。

β-葡聚糖、甘露聚糖、鉛化玻璃珠（粒徑0.45～0.60mm）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

LC1100高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；T6系列紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；Thermo Scientific MSC1.8生物安全柜：德國Thermo Fisher公司；HPS-160恒溫生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；2-16pk高速低溫冷凍離心機：美國Sigma-Aldrich公司；BSA22025精密電子分析天平：德國Sartorius公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗菌種制備

取4℃保存的BC、XR4斜面菌種3環(huán)，接種于含有300mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基的1.5 L三角瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后接種于50 L液體發(fā)酵罐中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

固態(tài)發(fā)酵：發(fā)酵料水比為1.00∶0.52（g∶mL），充分攪拌后，將混合好的發(fā)酵料堆放于發(fā)酵池（2 m×1.5 m×1.5 m）內(nèi)，料高55 cm。

1.3.2 采樣

用采樣器每隔3 h從固態(tài)發(fā)酵料表層下15～20 cm處均勻取樣100 g，緯線圈法[12]取樣225 g，混合均勻后，平均分為9份，3份樣品用于測定干質量，3份樣品用于測定葡聚糖和甘露聚糖，剩下3份在80℃條件下烘干至質量恒定，用于測定底物總糖。

1.3.3 底物干質量測定

稱取不同時間的樣品16g，80℃烘干至質量恒定，稱質量[9]。

1.3.4 葡聚糖和甘露聚糖含量的測定

酵母破壁：渦流微珠破壁法[13]。

收集多糖：處理后的樣品用冷卻的去離子水充分清洗，收集玻璃珠，并收集洗液，重復5次。沉淀物加入3 mL去離子水，充分振蕩，收集洗液，重復5次，合并洗液。將所得液體55℃靜置24 h蒸發(fā)水分[14]。

酸水解：多糖溶液加1.5 mL，72%的硫酸溶液，混勻，室溫條件下靜置3 h；然后加入7.7 mL去離子水使硫酸的最終濃度為2 mol/L，置于100℃水解4 h，取出冷卻至室溫后調(diào)pH為6.5～7.0，再用去離子水定容至25 mL[15]。

單糖含量測定色譜條件：采用高效液相色譜-示差折光檢測器測定樣品及校正多糖中甘露糖和無水葡萄糖含量[16]。用Ca型陽離子交換柱進行分離；以相對保留時間定性，色譜峰面積定量。流動相：100%水；柱溫：90 ℃；流速：0.5 mL/min。

樣品測定：以校正多糖的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標制備校正曲線，得出回歸方程。樣品的峰面積代入回歸方程中計算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。

1.3.5 底物總糖測定

采用苯酚-硫酸法[17]。

2 結果與分析

2.1 菌體生長動力學模型的建立

2.1.1 底物干重變化與菌體生物量關系的確定

在固態(tài)發(fā)酵過程中，將底物烘干后，底物組成為[10]：

根據(jù)BORZANI W等[10]研究可得：

式中：W為發(fā)酵料干質量，g；S為固態(tài)基質干質量，g；B為菌體生物量，g/g；P為產(chǎn)物質量，g/g；dW/dt為發(fā)酵料干質量變化率，g/h；dS/dt為固態(tài)基質消耗速率，g/h；dB/dt為菌體生長速率，g/h；dP/dt為產(chǎn)物生成速率，g/h。

在固態(tài)發(fā)酵過程中，底物的消耗主要由于菌體生長，維持菌體生長和生成產(chǎn)物造成[17]，因此，可將式（2）變換為：

其中，

式中：（dS/dt）g為菌體生長消耗固態(tài)基質速率，g/h；（dS/dt）m為菌體維持消耗固態(tài)基質速率，g/h；（dS/dt）p為產(chǎn)物生成消耗固態(tài)基質速率，g/h；Yg為菌體生物量相關系數(shù)；YP為產(chǎn)物生成相關系數(shù)；-km為維持菌體相關系數(shù)。

通過式（1）～（6）可得出底物干質量與菌體生物量的關系：

式中：γ，δ，k1和k2均為方程常數(shù)。

由BORZANI W等[10]的研究可知，固態(tài)發(fā)酵過程中底物干質量變化主要可分為2個階段，結合圖1中底物干質量變化可知，0～21 h為第1階段，21～30 h為第2階段，方程分別為：

式中：W1為第1階段發(fā)酵料干質量，g；W2為第2階段發(fā)酵料干質量，g；W0為發(fā)酵料起始干質量，g；B0為初始菌體生物量，g/g；μ為菌體生長比生長率，1/h，t為發(fā)酵時間，h；ta為第1階段結束時間，h；tb為第2階段結束時間，h；kt為方程常數(shù)。

由式（7）～（11）可得底物干質量的變化與菌體生物量的方程：

式中：Bs為不同時間菌體生物量，g/g。

將底物干質量結果帶入式（10）和式（11）中，利用Origin 8軟件進行曲線擬合，不同階段擬合曲線見圖1和圖2，擬合方程式：

對式（13）和（14）進行微分，得：

方程（13）和（14）的相關系數(shù)R2分別為0.9781和0.9673，方程均極顯著（P＜0.000 1），表明方程計算所得干質量值可以分別解釋第1階段97.81%的干質量變化和第2階段96.73%的干質量變化，說明曲線擬合度較好。

由式（10）、（12）、（13）和（15）可得第1階段菌體生物量的表達式：

由式（11）、（12）、（14）和（16）可得第2階段菌體生物量的表達式：

式中：B21表示第21小時菌體生物量，g/g。

2.1.2 Logistic模型的建立

Logistic模型是一個典型的S型曲線，通常被看作是一個表現(xiàn)細胞生長與營養(yǎng)物質之間的非線性關系的經(jīng)驗方程，能很好地反映該過程中菌體濃度增加對自身生長的抑制作用[18]，因此，采用此模型描述復合酵母生長動力學特性，Logistic方程[19]：

式中：Bm為最大菌體生物量，g/g；μm為菌體生長最大比生長率，1/h。

通過方程（17）和（18）計算所得生物量數(shù)據(jù)利用Origin8軟件進行擬合，擬合曲線見圖2，參數(shù)估計值見表1。

則復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵菌體生長動力學模型為：

方程（21）的相關系數(shù)R2為0.961 3，方程極顯著（P＜0.001），表明方程曲線擬合度較好，可以描述復合酵母菌在發(fā)酵過程中的生長情況。

2.2 產(chǎn)物生成動力學模型的建立

本研究用Luedeking-Piret方程來描述β-葡聚糖，甘露聚糖和菌體生長的關系[18]，即：

式中：α、β為動力學參數(shù)，當α=0，β≠0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為非偶聯(lián)型；α≠0，β≠0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為部分偶聯(lián)型；α≠0，β=0時，產(chǎn)物生成與菌體生長為偶聯(lián)型。

本研究中，β-葡聚糖和甘露聚糖為酵母細胞壁的主要成分，其中β-葡聚糖為酵母細胞壁的主要多糖[19-21]，由于以β-葡聚糖和甘露聚糖建立Luedeking-Piret方程研究較少，因此，對模型的建立進行分類討論。

（1）假設β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為偶聯(lián)型，即當β=0時，式（22）可簡化為：

當t=0時，P=P0，將方程（19）帶入方程（23）中，可得：

對式（24）積分得：

式中：P0為起始產(chǎn)物質量，g/g；P為不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量，g/g。

將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P，以及B、P0、B0帶入式（25）中，利用Matlab 7.0軟件，依最小二乘法求回歸系數(shù)，可得：α1=6.08，α2=1.96（α1為β-葡聚糖生成動力學參數(shù)，α2為甘露聚糖生成動力學參數(shù)）。

（2）假設β-葡聚糖和甘露聚糖的生成模型為部分偶聯(lián)型，即β≠0，

當t=0時，P=P0，將方程（19）帶入方程（22）中，可得：

對式（26）積分可得：

將不同時間點葡聚糖和甘露聚糖含量的P，以及B、P0、B0帶入式（27）中，利用Matlab 7.0軟件，依最小二乘法求回歸系數(shù)，可得：α1=8.3584，β1=-1.03×10-4，α2=1.96，β2=-3.26×10-5（β1為β-葡聚糖生成動力學參數(shù)，β2為甘露聚糖生成動力學參數(shù)）。

由于β1和β2的值近似為0，因此，可知兩種產(chǎn)物的生成與菌體的生長為偶聯(lián)型，則可得：

β-葡聚糖生成模型：

甘露聚糖生成模型：

方程（28）和（29）相關系數(shù)R2分別為0.935 2和0.928 8，方程均極顯著（P＜0.000 1），表明所選方程可以較好的反映產(chǎn)物生成的實際情況，相關性結果見圖3。

酵母發(fā)酵過程中，總糖的消耗與產(chǎn)物合成僅有間接關系，假設基質的消耗用于產(chǎn)物合成的比例很小，可忽略不計，認為總糖的消耗僅用于菌體的生長，所以式（30）可簡化為：

2.3 底物消耗動力學模型的建立

常用的底物消耗動力學模型是基于底物消耗物料恒算建立的Luedeking-Piret/like方程式[22]，即：將式（19）帶入式（31）積分得：

式中：St為底物總糖含量，g/g；St0為起始底物總糖含量，g/g；YB/t為總糖用于菌體生長的得率常數(shù)；Yp/t為總糖用于產(chǎn)物累計得率常數(shù)；K為維持常數(shù)。

將不同時間點的B，St和B0帶入式（32）中，利用Matlab 7.0軟件，依最小二乘法求回歸系數(shù)，可得：

St0=0.121g，YB/t=0.099。

則可得底物消耗動力學模型為：

方程（33）相關系數(shù)R2為0.990 7，方程均極顯著（P＜0.000 1），表明的所選方程可以很好的反映底物消耗的實際情況，相關性分析結果見圖4。

2.4 模型準確性分析

為了驗證模型的準確性，在相同條件下進行復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵的重復試驗3次，與動力學模型計算值進行比較，結果見表2。由表2可知，菌體生物量、甘露聚糖含量、β-葡聚糖含量和底物總糖含量的相對誤差都小于10%，說明建立的動力學模型能較好的描述生產(chǎn)實際中復合酵母菌固態(tài)發(fā)酵過程。

3 結論

以固態(tài)發(fā)酵料干質量變化為基礎，建立了復合酵母菌菌體生物量生長Logistic動力學模型相關系數(shù)R2為0.961 3，方程極顯著（P＜0.001），通過模型驗證，模型平均相對誤差為4.83%，表明在生產(chǎn)實際中復合酵母菌的生長符合Logistic方程。

通過對Luedeking-Piret方程參數(shù)α和β分類討論并計算，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖與甘露聚糖的生成與酵母菌為偶聯(lián)型，其中β-葡聚糖生成模型P=0.070 14+6.08（B-0.004 46），甘露聚糖生成模型P=0.035 4+1.96（B-0.004 46），相關系數(shù)R2分別為0.935 2，0.928 8，平均相對誤差分別為4.19%和4.08%，方程均極顯著（P＜0.000 1）。底物消耗動力學模型St=0.121+10.11（B-0.004 46），相關系數(shù)R2為0.990 7，平均相對誤差為6.1%，方程極顯著（P＜0.000 1），說明模型可較好描述發(fā)酵過程，對優(yōu)化實際生產(chǎn)工藝，控制和預測發(fā)酵過程具有重要的參考價值。

[1]劉大程，盧德勛，侯先志，等.不同品質粗飼料日糧對瘤胃發(fā)酵及主要纖維分解菌的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（4）：199-206.

[2]王麗娟，劉大程，盧德勛，等.日糧同時添加酵母培養(yǎng)物與延胡索酸二鈉與對慢性酸中毒奶山羊瘤胃發(fā)酵和細菌數(shù)量的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2009，21（1）：67-71.

[3]王二強，耿欣，李十中，等.甜高粱稈分批固態(tài)發(fā)酵制乙醇動力學研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（10）：1-4.

[4]魏培蓮，徐志南，彭勇，等.土曲霉固態(tài)發(fā)酵lovastatin的動力學研究[J].高?；瘜W工程學報，2008，22（6）：1010-1014.

[5]RAMANU M M V,THAKUR M S,KARANTH N G.Monitoring of biomass in solid-state fermentation using light reflectance[J].Biosens Bioelectron,1993,28(8):59-63.

[6]NG T B.A review of research on the protein-bound polysaccharide (polysaccharopeptide,PSP from the mushroomCoriolus versicolor(Basidiomycetes:Polyporaceae)[J].General Pharmacol,1998,30(1):1-4.

[7]DESGRANGES C,VERGOIGNAN C,GEORGES M,et al.Biomass estimation in solid state fermentation I.Manual biochemical methods[J]. Appl Microbiol Biot,1991,35(2):200-205.

[8]TEREBIZNIK M R,PILOSOF A M R.Biomass estimation in solid statefermentation by modeling dry matter weight loss[J].Biotechnol Tech, 1999,13(3):215-219.

[9]HASHEMI M,MOUSAVI S M,RAZAVI S H,et al.Mathematical modeling of biomass andα-amylase production kinetics byBacillussp.in solid-state fermentation based on solid dry weight variation[J].Biochem Eng J,2010,53(2):159-164.

[10]BORZANI W.A weighing method to identify the microbial growth phases in solid-state fermentation tests[J].World J Microbiol Biotechnol,2000,16(7):601-605.

[11]劉國娟，劉大程，盧春芳，等.復合菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].動物營養(yǎng)學報，2014，26（4）：1019-1027.

[12]劉小娜.固態(tài)發(fā)酵豆粕參數(shù)的科學性檢測[D].濟南：山東輕工業(yè)學院碩士論文，2012.

[13]LIU X Y,WANG Q,CUI S W,et al.A new isolation method of β-D-glucans from spent yeastSaccharomyces cerevisiae[J].Food Hydrocolloid,2008,22(2):239-247.

[14]FREIMUND S,SAUTER M,K PPELI O,et al.A new non-degrading isolation process for 1,3-β-D-glucan of high purity from baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae[J].Carbohyd Polym,2003,54(2):159-171.

[15]劉曉永.釀酒酵母β-D-葡聚糖制備、構象及免疫功效研究[D].無錫：江南大學博士論文，2007.

[16]劉曉涵，陳永剛，林勵，等.蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J].食品科技，2009，34（9）：270-272.

[17]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 22221—2008食品中果糖、無水葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定高效液相色譜法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[18]AMRANE A,PRIGENT Y.Mathematical model for lactic acid production from lactose in batch culture:model development and simulation [J].Biotechnol Progr,1994,11(5):558-564.

[19]WU Z F,DU G C,CHEN J,et al.Metabolic characters and fermentation kinetics of batch cultures to produce CoQ10 byRhizobium radiobacter [J].Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities,2004, 18(2):191-194.

[20]LUEDEKING R,PIRET E L.A kinetic study of the lactic acid fermentation.Batch process at controlled pH[J].Biotechnol Bioeng,2000,67 (6):636-644.

[21]FARKAS V.Biosynthesis of cell walls of fungi[J].Microbiol Rev, 1979,43(2):117-144.

[22]QIN F,SLETMOEN M,STOKKE B T,et al.Higher order structures of a bioactive,water-soluble(1→3)-β-D-glucan derived fromSaccharomyces cerevisiae[J].Carbohyd Polym,2013,92(2):1026-1032.

[23]NOBUYUKI S,HIDEMITSU K,SHIGEO S.Immunochemistry of pathogenic yeast,Candidaspecies,focusing on mannan[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci,2012,88(6):250-265.

WANG Yong1,2,ZHANG Jinling1,2,ZHANG Liming1,2,GUO Peng1,2,YUAN Lijia1,LIU Dacheng1,2*

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Animal Clinical Diagnosis Technology,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The kinetics model of solid state fermentation by compound yeast was studied and the biomass was determined based on dry weight variation.The optimal parameters were estimated and nonlinear fitting was performed by logistic model,Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret/like equation.The kinetics model of biomass growth,β-glucan production,mannan synthesis and total sugar consumption were established, respectively.Through the calculation on Luedeking-Piret model,the results showed that the synthesis of β-glucan and mannan was link-coupled with cell.The experimental data were compared with the predicted ones,it showed the average relative error was generally less than 10%,which indicated that the kinetic models can reflect the dynamic characteristics of composite yeast fermentation process.The results showed that the models can guide the practical production significantly.

compound yeast;solid-state fermentation;β-glucan;mannan;kinetic model

S816

A

0254-5071（2015）04-0066-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.015

2015-03-06

國家自然科學基金項目（31260560）；內(nèi)蒙古科技廳專利轉化項目（20140185）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學科技成果轉化項目（CGZH2013007）

王勇（1988-），男，碩士研究生，研究方向為反芻動物微生態(tài)制劑。

*通訊作者：劉大程（1968-），男，教授，博士，研究方向為反芻動物微生態(tài)制劑。