齊紅雙　薛士鵬　李英　馬敬花　楊瀚

多重PCR技術(shù)在診斷南陽地區(qū)志賀菌引起的腹瀉患者中的應(yīng)用

齊紅雙1薛士鵬2李英1馬敬花1楊瀚1

目的 研究多重PCR技術(shù)在對南陽地區(qū)志賀菌感染導(dǎo)致腹瀉的診斷及血清分型中的應(yīng)用。方法 收集醫(yī)院腹瀉患者糞便，進(jìn)行分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)分型，將初篩的志賀菌通過多重PCR技術(shù)對毒素基因shetA、shetB、 ial和ipaH進(jìn)行擴(kuò)增檢測。結(jié)果 結(jié)合臨床癥狀和生化鑒定初篩的志賀菌共有83株，血清學(xué)鑒定為福氏志賀菌的有50株，宋內(nèi)志賀菌28株，鮑氏志4株，痢疾志賀菌1株。通過多重PCR對取得的83株志賀菌進(jìn)行擴(kuò)增后在423bp（ipaH）處出現(xiàn)了條帶，與常規(guī)方法鑒定得到的結(jié)果一致。結(jié)論 南陽地區(qū)細(xì)菌性痢疾感染者以福氏志賀菌為主要感染菌，多重PCR技術(shù)能夠快速、簡便、特異敏感地對志賀菌進(jìn)行檢測。

志賀菌；PCR；檢測；診斷；分型

志賀菌（shigellosis）又稱痢疾桿菌，是引起人類細(xì)菌性腹瀉的主要病因之一，感染人體后通過侵犯小腸黏膜上皮細(xì)胞，使上皮細(xì)胞變性壞死，從而引起腹瀉。根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同可分為痢疾、福氏、鮑氏和宋內(nèi)志賀菌。長期以來，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)在對痢疾的診斷中發(fā)揮了重要的作用，檢測至少要48 h且步驟繁瑣，還存在許多難以控制的客觀因素。容易產(chǎn)生誤診和漏診，會延誤疾病治療的最佳時(shí)機(jī)。本研究通過多重PCR技術(shù)對南陽地區(qū)腹瀉患者糞便中擴(kuò)增痢疾的侵襲性基因（ipaH）［1］及相關(guān)的基因位點(diǎn)（ial），將為臨床快速準(zhǔn)確地診斷志賀菌提供理論基礎(chǔ)，并且可以避免許多不可控因素。

1　材料與方法

1.1材料

83株志賀菌都是在2014～2015年從南陽南石醫(yī)院及南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院收集的腹瀉患者的黏液膿血便標(biāo)本，然后進(jìn)行分離鑒定。所用培養(yǎng)基、生化反應(yīng)試劑、志賀菌診斷血清購于鄭州生物科技公司。

1.2方法

1.2.1將從本院及周邊醫(yī)院收集到的黏液膿血便標(biāo)本接種在SS和MacoConkey培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，37℃ 24 h后取可疑菌落轉(zhuǎn)種到KIA和MIU培養(yǎng)基上進(jìn)行生化鑒定。直接用全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定，最終通過玻片凝集進(jìn)行血清型鑒定。

1.2.2多重PCR檢測 將鑒定過的志賀菌過夜培養(yǎng)18～24 h，再取100 μl培養(yǎng)菌液，3 000 r/min離心后棄上清再加50 μl去離子水，沸水煮10 min后5 000 r/min離心，取上清液為PC R模板。設(shè)計(jì)引物如下setlA：P1-TCA CGC TAC CAT CAA AGA P2-TAT CCC CCT TTG GTG GTA，setlB：P3 GTG AAC CTG CTG CCG ATA TC P4 ATT TGT GGA TAA AAA TGA CG，ial：P5-CTG GAT GGT ATGGTG AGG，P6-GGA GGC CAA CAA TTA TTT CC，ipaH：P7-TGG AAA AAC TCA GTG CCT CT，P8-CCAGTCCGT AAA TTCATT CT。反應(yīng)體系為如下：buffer（Mg+） 5 μl，模板各為2 μl，引物各1 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 4 min，94℃變性60 s，55℃退火60 s，最后72℃延伸8 min，共循環(huán)35次。同時(shí)設(shè)陰性對照。凡出現(xiàn)了423 bp的條帶外，再出現(xiàn)309 bp（setlA基因）、147 bp（setlB基因）以及320 byGal基因中任意一個(gè)出現(xiàn)條帶，均為陽性。

2　結(jié)果

2.1樣本收集結(jié)果

通過分離培養(yǎng)和生化鑒定，我們共得到83株志賀菌，然后再通過玻片凝集進(jìn)行血清型鑒定，我們鑒定出來共有福氏志賀菌50株，宋內(nèi)志賀菌28株，鮑氏志賀菌4株，痢疾志賀菌1株。

2.2多重PCR檢測結(jié)果

通過多重PCR擴(kuò)增后，我們鑒定的83株志賀菌均在423 bp處出現(xiàn)了條帶，其余的在147，309，320 bp處均出現(xiàn)了至少一個(gè)條帶，與常規(guī)鑒定法一致。

3　討論

通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，福氏志賀菌是我市引起腹瀉的主要菌群，與國內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道相一致［2］。志賀菌和一些腸桿菌科細(xì)菌生長和生化特性非常相近，所引起細(xì)菌性腹瀉的臨床癥狀也很難區(qū)分。所以對其病原學(xué)的診斷就顯得尤為重要了，本研究采用多重PCR對志賀菌進(jìn)行檢測。多重PCR的特點(diǎn)是快速、高敏感性、高特異性，已經(jīng)被國外的學(xué)者［3］用于細(xì)菌性腹瀉的檢測，尤其是對標(biāo)本的量較少或者經(jīng)過藥物治療后活菌量不多的標(biāo)本。

對志賀菌的致病性和基因型我們已經(jīng)基本闡明，選取ipaH、ial、shetA、和shetB基因作為目的基因是因?yàn)锽uysse［4］等發(fā)現(xiàn)各型志賀菌都有ipaH的存在，不會隨傳代而丟失，所以被認(rèn)為是志賀菌的管家基因。單用ipaH基因PCR結(jié)果陽性并不一定發(fā)病，多是痢疾桿菌攜帶者。侵襲相關(guān)基因ial存在于侵襲性大質(zhì)粒上一個(gè)2.5 kb侵襲相關(guān)區(qū)段中，是志賀菌的毒力基因，由兩種志賀菌腸毒素shetA，shetB編碼基因。菌痢患者除了ipaH基因陽性外，ial或hetA、hetB基因檢測同時(shí)陽性，才能證明是痢疾桿菌感染，且具有致病性。

本研究對分離出的83例腹瀉標(biāo)本進(jìn)行多重PCR鑒定，像普通的PCR一樣，只是在PCR體系中多增加了幾對引物，反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同，卻又表現(xiàn)出了PCR法的高特異性。檢驗(yàn)過程用時(shí)短，快速準(zhǔn)確，是一種較為理想可靠的檢測志賀菌的方法。

［1］Schroeder GN，Hilbi H. Molecular pathogenesis of Shigella spp：controlling host cell signaling，invasion，and death by typeⅢ secretion［J］. Clin Micmbiol Rev.，2008，21（1）：134-156.

［2］李頤，羅蓓，胡雪明，等. 上海市靜安區(qū)2005-2008年分離到的志賀菌血清型分布及耐藥性分析［J］. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，38（15）：3089-3090，3094.

［3］李小麗，陰赪宏，溫艷，等. PCR快速檢測腹瀉患者糞中痢疾桿菌致病基因ipaH和ial［J］. 世界華人消化雜志，2007，15 （19）：2128-2132.

［4］Phantouamath B，Sithivong N，Insisiengmay S，et al. Pathogerticity of Shigella in healthy carvers: a study in Vientiane， Lao People， Democratic Republic［J］. Jpn J Infect Dis.，2005，58（4）：232-234.

Application of Multiplex PCR Technique in the Diagnosis of Diarrhea Caused by Shigella in Nanyang Area

QI Hongshuang1XUE Shipeng2LI Ying1MA Jinghua1YANG Han1， 1 Department of clinical laboratory， Nanyang Nanshi hospital， Nanyang 473000， China， 2 Nanyang Medical College， Nanyang 473000， China

Objective The study of multiple PRC technology in the diagnosis of diarrhea caused by shigella infection in Nanyang area and the application of serum typing. Methods The feces of patients with diarrhea in hospital were collected and cultured， biochemical identification and serological typing. The， ial， shetB and shetA of ipaH were amplified by multiple PCR. Results Combined with clinical symptoms and biochemical screening of shigella in a total of 83 strains， serological identification of shigella flexneri has 50 strains， 28 strains of shigella sonnei， bao s boydii 4 strains， shigella dysenteriae 1 strain. The 423bp （ipaH） was amplified by multiplex PCR， and the results were consistent with the conventional method. Conclusion Shigella dysentery infection in Nanyang area is mainly infected by shigella， and multiplex PCR technology can quickly， easily and specifically sensitive to detection.

Shigella， PCR， Detection， Diagnosis， Typing

R378

A

1674-9308（2015）33-0038-02

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.33.025

1 473000 南陽南石醫(yī)院檢驗(yàn)科；2 473000 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校