金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB表達的影響

劉子宸，吳　棣，王　剛，李永剛，劉少斌，張獻彩

(1.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校解剖教研室;2.邢臺市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 邢臺　054000)

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金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷大鼠肺組織中核因子-κB表達的影響

劉子宸1，吳棣2，王剛1，李永剛1，劉少斌1，張獻彩1

(1.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校解剖教研室;2.邢臺市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 邢臺054000)

摘要：目的探討金納多注射液對脂多糖致急性肺損傷(ALI)大鼠肺組織中核因子-κB(NF-κB)表達的影響。方法 采用隨機法將24只Wistar大鼠分為3組：對照組(Control)、脂多糖組(LPS)和金納多處理組(GBE)。采用尾靜脈注射脂多糖(LPS)的方法建立急性肺損傷模型，光學顯微鏡下觀察每組大鼠的肺組織病理學改變；檢測血清中腫瘤壞死因子-αB(TNF-αB)和肺組織中核因子-κB(NF-κB)的表達變化。結(jié)果與對照組相比，脂多糖組大鼠血清中TNF-αB含量升高(P<0.05)，肺組織中NF-κB表達增加(P<0.05)；與脂多糖組相比，金納多處理組大鼠血清中TNF-αB含量減少(P<0.05)，肺組織中NF-κB表達減少(P<0.05)。結(jié)論 金納多注射液可有效減輕ALI時肺組織的炎癥反應，其機制可能與其降低大鼠體內(nèi)TNF-α含量、減少NF-κB表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:急性肺損傷；金納多；脂多糖；腫瘤壞死因子-α；核因子-κB

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素所導致的肺泡上皮細胞及肺毛細血管內(nèi)皮細胞屏障功能喪失，從而導致的缺氧性呼吸衰竭，是機體炎癥反應失控導致的自身破壞性反應的結(jié)果。ALI時，大量富含蛋白的滲出液流入到肺泡腔，嚴重影響肺的換氣功能，導致頑固性低氧血癥和進行性呼吸衰竭，可誘發(fā)肺炎、胰腺炎、敗血癥等多種嚴重并發(fā)癥，是臨床常見的危急重癥[1-5]。在眾多病因中，重癥感染為其原因之一，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，是引起感染性疾病的主要因素。ALI發(fā)病機制十分復雜，迄今為止尚未闡明，目前仍無有效的特異性的治療方法[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)：眾多細胞因子和炎性介質(zhì)參與了ALI的發(fā)生發(fā)展過程。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)為ALI時的炎癥啟動因子，降低體內(nèi)TNF-α的含量可顯著緩解肺損傷；核因子-κB(NF-κB)的激活在ALI中起著關(guān)鍵作用，NF-κB受到脂多糖及炎性細胞因子刺激活化后可加重ALI時的肺部損傷，減少NF-κB的表達可有效抑制ALI時炎癥反應，減輕肺組織的損傷程度[9-11]。

銀杏是銀杏科植物的一種，銀杏葉主要為銀杏干燥葉，其主要成分為萜內(nèi)酯類、黃酮類、少量生物堿及多酚類化學物質(zhì)。銀杏葉提取物(GBE，金納多)主要含有黃酮苷和銀杏內(nèi)酯等有效成分，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、保護血管內(nèi)皮及改善微循環(huán)等作用，臨床上多用來保護心腦血管、改善心肌缺血、緩解心絞痛、降低血清甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量等。目前針對銀杏葉提取物的研究大多數(shù)為其防治缺血再灌注損傷性疾病，但關(guān)于其防治ALI的研究較少[12-16]。因此，本實驗采用尾靜脈注射脂多糖(LPS)的方法復制大鼠ALI模型，旨在觀察銀杏葉提取物對ALI的作用，探討其可能的對抗機制，為臨床抗ALI的藥物治療提供一定的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物、所用試劑和儀器健康雄性SPF級Wistar大鼠24只，體質(zhì)量210～240 g，由河北省實驗動物中心提供，動物合格證編號：1308046。金納多注射液(德國威瑪舒培博士藥廠，規(guī)格：每支5 mL，含GBE 17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg)；脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；TNF-α檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；NF-κB抗體及免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；切片機(型號：RM2135，德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物分組及ALI模型制備領(lǐng)取實驗大鼠后，鼠籠內(nèi)覆蓋潔凈墊料，給予充足的飼料和水，適應性飼養(yǎng)3 d。室內(nèi)環(huán)境：溫度24℃左右，相對濕度40%～60%。將24只大鼠隨機分為3組：對照組(Control)、脂多糖組(LPS)和金納多處理組(GBE)。對照組每只大鼠于尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，注射劑量為0.1 mL·kg-1；脂多糖組每只大鼠于尾靜脈注射LPS，注射劑量為0.1 mL·kg-1(濃度為50 g·L-1)；金納多處理組每只大鼠于尾靜脈注射LPS，注射劑量為0.1 mL·kg-1(濃度為50 g·L-1)，并于注射LPS前30 min腹腔注射金納多，注射劑量為50 mg·kg-1。所有大鼠于注射相應溶液3 h后處死取材。

1.3肺組織病理形態(tài)學觀察大鼠經(jīng)10%水合氯醛(使用劑量為3 mL·kg-1)麻醉后，迅速打開胸腔，取部分右肺下葉組織，常規(guī)甲醛固定、乙醇梯度脫水(70%、90%乙醇各60 min→95%乙醇Ⅰ過夜、95%乙醇Ⅱ 30 min→100%乙醇Ⅰ、 Ⅱ各60 min)、二甲苯透明(二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min)、石蠟包埋(石蠟Ⅰ 30 min、 石蠟Ⅱ 2.5 h)、切片(厚度5 μm)，行普通HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.4血清中TNF-α含量的檢測大鼠經(jīng)腹主動脈采血，離心(4℃，2 000 r·min-1)10 min后取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定血清中TNF-α(ng·L-1)的濃度變化。嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5免疫組織化學染色技術(shù)觀察肺組織中NF-κB的表達變化常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟水化，經(jīng)0.01 mol·L-1PBS清洗→3 %甲醇—過氧化氫，室溫下孵育15 min→0.01 mol·L-1PBS清洗→0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)，微波抗原修復，98℃ 15 min→冷卻至室溫后0.01 mol·L-1PBS清洗→正常山羊血清孵育，37℃ 30 min→滴加一抗(1 ∶100)，37℃下1.5 h →0.01 mol·L-1PBS清洗→加入生物素標記的二抗及辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素→0.01 mol·L-1PBS清洗→DAB顯色→梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察，以細胞漿或細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號。為了排除非特異性染色，在陰性對照實驗中，用PBS代替一抗或者二抗后，未見陽性染色。每組隨機選取5張切片，每張切片隨機選取5個不重疊的視野，光學顯微鏡下進行觀察，應用圖像分析系統(tǒng)軟件進行平均吸光度(OD值)的測量，以平均OD值代表該張切片NF-κB的表達水平。

2結(jié)果

2.1肺組織形態(tài)學觀察Control組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肺泡隔壁薄光滑，均勻一致，肺泡腔內(nèi)無滲出液；LPS組肺間質(zhì)大量炎細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)大量紅細胞；GBE組肺組織炎細胞浸潤及肺泡腔出血減少，肺損傷程度減輕，見圖1。

Control組LPS組GBE組

圖1各組大鼠肺組織病理形態(tài)學改變(HE×400)

2.2血清中TNF-α含量檢測與Control組相比，LPS組肺組織中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)，與LPS組相比，GBE組TNF-α含量明顯降低(P<0.05)，但仍高于Control組(P<0.05)，見表1。

2.3肺組織中NF-κB免疫組織化學染色結(jié)果Control組肺組織NF-κB表達的棕黃色陽性信號較弱；LPS組NF-κB陽性信號明顯增強(P<0.05)，胞核與胞漿均呈陽性表達；GBE組NF-κB陽性信號減弱，陽性表達的胞核顯著減少(P<0.05，見表1，圖2)。

表1　 TNF-α含量及NF-κB表達檢測結(jié)果

注：與Control組相比*P<0.05;與LPS組相比#P<0.05。

Control組 LPS組GBE組

圖2各組大鼠肺組織NF-κB表達結(jié)果 (×400)

3討論

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒等原因引起的機體過度炎癥反應并導致彌漫性肺實質(zhì)損傷，其特征性病理改變是肺實質(zhì)炎癥反應所導致的彌漫性肺泡上皮和肺微血管內(nèi)皮的嚴重損傷。ALI嚴重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，是臨床重癥監(jiān)護患者主要的死亡原因，病死率達到30%～50%。ALI時，肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，導致彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，肺順應性降低、通氣/血流比例失調(diào)，臨床上表現(xiàn)為進行性低氧血癥和呼吸窘迫。ALI不僅是單純意義上的肺部疾病，而是一種全身系統(tǒng)性疾病的肺部表現(xiàn)，是機體嚴重炎癥反復的結(jié)果，調(diào)控炎癥反應可以防止ALI的發(fā)生發(fā)展，降低死亡率。ALI的發(fā)病包括氧化損傷、中性粒細胞的活化、促炎細胞因子的大量釋放等多種機制，最終產(chǎn)生炎性“瀑布”樣反應，目前專家們對其發(fā)病機制尚未完全進行闡釋[17-22]。本實驗通過大鼠靜脈注射LPS建立ALI模型，20 min后大鼠精神萎靡，反應遲鈍，毛發(fā)聳立，呼吸急促，攝食飲水極少。病理學檢查發(fā)現(xiàn)：注射LPS后大鼠肺泡壁大量炎細胞浸潤、肺泡腔出血，提示成功復制了ALI模型；應用金納多注射液后，以上病理改變有效緩解，說明金納多注射液可有效對抗ALI時肺組織的炎癥反應。

研究發(fā)現(xiàn)TNF-α主要由被激活的巨噬細胞產(chǎn)生，是機體遭受感染或創(chuàng)傷后最早產(chǎn)生的促炎性細胞因子之一，是ALI發(fā)生和發(fā)展的始動因素。TNF-α能夠誘導IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子的分泌，促發(fā)炎癥反應，其水平可反應ARDS患者肺部損傷的嚴重程度。TNF-α對肺有強烈的毒性，能誘導肺內(nèi)皮細胞活化、白細胞遷移、中性粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏，肺泡內(nèi)積聚的水腫液進一步阻礙肺泡細胞的血流灌注和氧氣交換，加重低氧血癥。TNF-α能增加白細胞表面的黏附分子，使淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)增加，巨噬細胞抗原-1(MAC-1)增加；通過檢測ARDS病人和對照組的血清TNF-α含量發(fā)現(xiàn)：ARDS患者TNF-α明顯升高，且與肺損傷程度密切相關(guān)；通過減少TNF-α的水平，有利于減輕ALI時的炎癥反應[23-25]。本實驗顯示： LPS組較Control組大鼠血清中TNF-α含量增加(P<0.05)，證實TNF-α及NF-κB參與了ALI進程；應用金納多處理后，血清中TNF-α含量降低(P<0.05)，提示金納多可有效降低TNF-α含量，抑制炎癥反應。

NF-κB是一類能與多種細胞因子及黏附分子基因啟動子部位的κB位點發(fā)生結(jié)合并增強基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，是炎癥病理過程中多種炎性介質(zhì)表達調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在啟動、放大和延續(xù)炎癥反應過程中起中樞性調(diào)控作用。當細胞受到氧化、應激等因素的刺激后，NF-κB在細胞核內(nèi)與DNA特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)炎性細胞因子、細胞增殖等基因的轉(zhuǎn)錄，參與體液免疫、固有免疫、炎癥調(diào)節(jié)等，在ALI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。未受刺激時，NF-κB處于未活化狀態(tài)，其與抑制蛋白IκB結(jié)合在一起；當受到LPS等刺激時，IκB發(fā)生磷酸化和降解，NF-IκB與IκB解離，獲得自由的NF-IκB迅速從細胞質(zhì)移位到細胞核，與基因上κB位點發(fā)生特異性結(jié)合，從而促進有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB調(diào)節(jié)的靶基因蛋白包括細胞因子(IL-1、IL-2、IL-3、IL-6)、趨化因子(IL-8、巨噬細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞炎性蛋白-1A)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)等。實驗表明：內(nèi)毒素導致，TNF-α等血清促炎細胞因子水平的升高，單核細胞或外周單核細胞及肺泡巨噬細胞NF-κB活性的增強。內(nèi)毒素進入機體后，可激活NF-κB核易位啟動TNF-α表達，釋放的TNF-α與LPS進一步激活效應細胞的NF-κB活化，進而啟動其他細胞因子和黏附分子的炎癥分子的表達，抑制NF-κB的激活可有效降低肺損傷的發(fā)生[26-30]。本實驗顯示： LPS組較Control組大鼠肺組織NF-κB表達增多(P<0.05)，證實NF-κB參與了ALI進程；應用金納多處理后，肺組織NF-κB表達減少(P<0.05)，提示金納多可有效抑制NF-κB表達，保護肺組織。

綜上所述，金納多可能通過降低TNF-α的含量、抑制NF-κB的表達發(fā)揮對ALI時肺組織的保護作用。

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基金項目：邢臺市科學技術(shù)研究發(fā)展計劃自籌經(jīng)費項目(No 2013ZC179)

通信作者：張獻彩，女，副教授，研究方向：糖尿病消化系統(tǒng)癥狀的研究,E-mail:zhangxiancai2004@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.011

(收稿日期：2015-07-29，修回日期：2015-09-07)

Effect of Ginaton injection on the expression of NF-κB
in rats with acute lung injury induced by LPS

LIU Zi-Chen1, WU Di2,WANG Gang1,et al

(1.XingtaiMedicalCollege;2.TheThirdHospitalofXingtai,Xingtai,Hebei054000,China)

Abstract:Objective To explore the effect of Ginaton injection on the expression of NF-κB in rats with acute lung injury. Methods Twenty-four male Wistar rats were randomized into three groups:control group, LPS group and GBE group. Model of acute lung injury was established by tail-vein injection with LPS. Morphological changes of lung tissues were observed under light microscope. The content of TNF-α in serum and the expression of NF-κB in lung tissues were detected in each group. Results Compared with control group, the content of TNF-α in serum increased (P<0.05) and the expression of NF-κB in lung tissues increased (P<0.05) in LPS group; Compared with LPS group, the content of TNF-α in serum decreased (P<0.05) and the expression of NF-κB in lung tissues decreased (P<0.05) in GBE group. Conclusion Ginaton injection could reduce inflammation reaction in lung tissues during ALI, the mechanism of which was probably related to the decrease in the content of TNF-α and the expression of NF-κB.

Key words:acute lung injury;ginaton;LPS;TNF-α;NF-κB