林曉冬,韓　娟(綜述),程艷玲(審校)

(1.山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，濟南250101； 2.山東大學藥學院，濟南 250012； 3.山東省立醫(yī)院心胸外科，濟南250101)

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反流性食管炎的研究進展——模型構(gòu)建與發(fā)病機制

林曉冬1,2△※,韓娟3(綜述),程艷玲1(審校)

(1.山東省藥學科學院 山東省化學藥物重點實驗室，濟南250101； 2.山東大學藥學院，濟南 250012； 3.山東省立醫(yī)院心胸外科，濟南250101)

摘要：反流性食管炎(RE)是臨床常見的食管黏膜炎性病變，其與食管下括約肌功能失調(diào)，胃液或混合腸液反流刺激等原因密切相關(guān)。但至今RE的機制尚不明確，其發(fā)生可能由免疫因子介導(dǎo)，與氧化應(yīng)激、化學損傷有關(guān)；其發(fā)展可能由Wnt/β聯(lián)蛋白、磷脂酰肌醇3-激酶/絲-蘇氨酸蛋白激酶、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶等信號通路調(diào)控。RE的發(fā)病機制研究，為RE模型評價、新藥篩選以及臨床治療提供實踐參考和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:反流性食管炎；模型研究；細胞因子；信號通路；機制

反流性食管炎(reflux esophagitis,RE)是臨床常見的上消化道疾病，是由食管下括約肌功能失調(diào)，胃液或混合腸液反流刺激等原因引起的食管黏膜炎性病變。抑酸療法是目前臨床治療RE的主要方法，胃酸抑制劑在食管炎愈合和癥狀減輕方面有良好的療效，但是仍有部分患者的癥狀得不到明顯改善，病情持續(xù)發(fā)展。特別是近年來，由于工作、學業(yè)等壓力增大和不良生活習慣等諸多不利因素的影響，RE發(fā)病率有增高趨勢[1]。RE動物模型研究是消化系統(tǒng)藥物臨床前研究的重要部分，RE發(fā)病機制一直是醫(yī)學理論和實踐研究關(guān)注的熱點，現(xiàn)就RE模型構(gòu)建方法與發(fā)病機制予以綜述。

1RE模型的構(gòu)建方法

大鼠較犬、豬等實驗動物具有飼養(yǎng)成本低、操作方便、實驗條件易于控制等優(yōu)點，因此大鼠RE動物模型在基礎(chǔ)研究和新藥評價中得到廣泛應(yīng)用。大鼠RE模型的建立方法主要可分為手術(shù)造模和非手術(shù)造模，手術(shù)造模法較為常見。手術(shù)造模法可分為賁門肌切開伴消化道結(jié)扎術(shù)和消化道重構(gòu)吻合術(shù)二類。

1.1賁門肌切開伴消化道結(jié)扎術(shù)賁門肌切開伴消化道結(jié)扎術(shù)是制備RE動物模型的最常用方法。大鼠經(jīng)麻醉、固定、消毒后，取劍突下腹部正中切口，自賁門起，沿賁門肌縱行分離，長度約1 cm，深度至黏膜層，用手術(shù)線縫扎幽門或其他胃腸消化道，以利于胃液向食管反流。

1.1.1賁門肌切開術(shù)+幽門結(jié)扎術(shù)該方法具有手術(shù)快捷簡便、模型成功率高的特點，形成的模型能較好地模擬胃食管反流病幽門梗阻的病理特征和RE的形成過程。根據(jù)幽門結(jié)扎的程度不同可以分為完全幽門結(jié)扎法和半幽門結(jié)扎法。完全幽門結(jié)扎法，術(shù)后動物無法正常進食，造成不可逆的幽門梗阻，動物由于胃穿孔導(dǎo)致體內(nèi)嚴重的酸堿失衡，通常不能堅持生存超過48 h。此類模型適用于針對RE且起效迅速的制劑研究[2]。應(yīng)用該方法，動物經(jīng)預(yù)空腹，胃液儲積在胃內(nèi)，可用吸管、注射器等收集，方法簡便，可造成明顯的胃出血、潰瘍、穿孔；但是由于術(shù)后觀察期短，該方法無法觀察到巴雷特食管(Barrett′s esophagus,BE)的發(fā)生。半幽門結(jié)扎法術(shù)后需適度補充營養(yǎng)液，適時逐步調(diào)整為軟質(zhì)飼料，可提高存活率，延長術(shù)后觀察期，形成的模型較為明顯。

1.1.2賁門肌切開術(shù)+十二指腸或結(jié)腸結(jié)扎術(shù)該方法能形成混合有胃液、胰液、膽汁、腸液等消化液的混合性食管炎模型，手術(shù)快捷簡便、模型成功率較高，能反映食管在消化液復(fù)雜環(huán)境下的病理情況。與賁門肌切開術(shù)+結(jié)扎幽門術(shù)比較，此類模型不可避免地產(chǎn)生較大的創(chuàng)面，愈合期稍長。

1.2消化道重構(gòu)吻合術(shù)消化道重構(gòu)吻合術(shù)是一類制備RE動物模型常見的方法，但這類術(shù)式較為復(fù)雜。王瑞華等[3]對食管空腸吻合、食管十二指腸吻合、食管空腸吻合+胃切這3種方法及手術(shù)關(guān)鍵點進行了探討總結(jié)，術(shù)后12周病死率分別為6/20、7/20、6/20；前2種模型不但形成了RE，一段時間飼養(yǎng)后還形成了BE，因此前2種模型對正常食管→RE→BE的過程研究有一定生理意義。楊路亭等[4]對3類慢性胃食管反流病進行了比較研究，包括：食管胃十二指腸吻合術(shù)、幽門部分縫扎+賁門肌切開術(shù)改行胃底食管吻合術(shù)、食管空腸吻合術(shù)改行膽總管開口遠側(cè)十二指腸與食管吻合術(shù)，術(shù)后非預(yù)期病死率分別為18/37、1/20、7/21。采用吻合手術(shù)病死率普遍較高，主要原因有梗阻、感染、窒息、出血、吻合口瘺和穿孔等。此外，對設(shè)備要求高，技術(shù)難度大，手術(shù)耗時較長且容易出現(xiàn)多種并發(fā)癥。因此，吻合術(shù)對試驗過程的一致性和規(guī)范性提出了更高的要求。實際操作中，越復(fù)雜的吻合術(shù)對熟練的要求越高，手術(shù)時間也就越長，這必然對麻醉水平提高要求，同時增加術(shù)后并發(fā)癥的誘導(dǎo)因素，還在一定程度上降低了存活率和模型的一致性。與破壞食管下括約肌或食管胃腸道吻合術(shù)的方法比較，結(jié)扎幽門或十二指腸潰瘍法制備的RE模型，不改變食管下括約肌的結(jié)構(gòu)及正常消化的排列，能較好地模擬人體RE的病理生理過程[5]。

1.3Gy60Co γ射線照射法建立放射性元素照射誘導(dǎo)的食管炎模型對實驗設(shè)備及安全防護有較高的要求，國內(nèi)開展的較少。Wang等[6]通過Gy60Co γ射線照射的方法誘導(dǎo)了食管炎模型，然而這種模型會損害免疫系統(tǒng)功能，在輻照后第14 d，大鼠外周血淋巴細胞百分比、T淋巴細胞數(shù)和Th細胞數(shù)顯著降低。

1.4化學燒傷法化學燒傷法是通過酸或堿直接與黏膜組織接觸造成黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)毒性損傷的方法。通過灌胃給予1 mL 的1 mol/L HCl溶液和1 mL的50%NaOH溶液能分別形成酸性和堿性燒傷性食管炎[7]。灌胃過程對食管壁內(nèi)的作用、酸或堿與食管壁的作用強度大小、時間長短以及攝入體內(nèi)的酸或堿對機體毒性的影響等諸多不確定因素的存在，或許是該模型未得到廣泛應(yīng)用的原因，該模型在很多方面有待深入研討。

2診斷標準

由于動物模型建立的方法存在差別，國內(nèi)外未見對于RE模型評價的統(tǒng)一標準。雖然《反流性食管炎診斷及治療指南(2003年)》可提供參考，但與臨床研究相比，動物實驗由于實驗對象不同和實驗條件限制往往導(dǎo)致自發(fā)、原發(fā)性的病變難以及時發(fā)現(xiàn)。國際上對RE臨床內(nèi)鏡檢查普遍認可洛杉磯分級[8]，并以監(jiān)測24 h食管內(nèi)pH值作為診斷RE的重要依據(jù)[9]，并結(jié)合內(nèi)鏡檢查、多通道腔內(nèi)阻抗聯(lián)合 pH監(jiān)測、質(zhì)子泵抑制劑試驗、X線鋇餐及放射性核素檢查、食管測壓、膽汁反流測定等多種診斷手段。以上各診斷手段各有優(yōu)勢，不同類型的病癥在診斷方法的選擇上也有差異，目前國際上尚無明確統(tǒng)一的診斷標準[10]。

3發(fā)病機制

RE是胃腸動力障礙性疾病，其病理生理機制主要是抗反流防御機制下降和反流物對食管黏膜攻擊作用增強的結(jié)果[11]。一般認為酸反流是引起食管黏膜損傷的主要因素，黏膜損傷的嚴重程度取決于食管黏膜對反流物質(zhì)的清除能力，而食管黏膜清除能力依靠食管平滑肌收縮和舒張的協(xié)調(diào)[12]。然而近年來，隨著RE有關(guān)細胞因子和信號通路研究的深入，氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)等理論在RE研究中得到體現(xiàn)。

3.1RE相關(guān)的細胞因子

3.1.1胃腸激素一大類統(tǒng)稱為胃腸激素的物質(zhì)與食管平滑肌收縮和舒張協(xié)調(diào)密切相關(guān)。胃泌素、P物質(zhì)、蛙皮素和胃動素均能使食管下括約肌收縮，食管下括約肌壓力升高；而血管活性腸肽、膽囊收縮素、生長抑素、阿片肽、降鈣素基因相關(guān)肽、一氧化氮和一氧化碳則能使食管下括約肌舒張，降低食管下括約肌壓力[13-14]。這些胃腸激素導(dǎo)致食管括約肌的收縮或者舒張，進而影響胃酸、胰液、十二指腸液等攻擊因子對食管的損傷作用。

3.1.25-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)5-HT是參與調(diào)節(jié)胃腸道運動和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與胃腸道排空及分泌等生理機制密切相關(guān)；在胃腸道5-HT諸多亞型受體中，5-HT3受體在調(diào)節(jié)賁門肌對松弛反射、酸刺激以及電刺激的敏感性方面發(fā)揮重要作用[15]。5-HT4受體則參與蠕動反射，通過縱向切開賁門肌建立的RE模型的研究證實，選擇性再攝取轉(zhuǎn)運蛋白的增加和5-HT4受體的減少會削弱5-HT對效應(yīng)細胞的影響，引發(fā)食管平滑肌收縮和舒張功能的協(xié)調(diào)障礙，同時降低回流物質(zhì)的清除能力，從而引起食管黏膜損傷、食管炎[12]。

3.1.3氧自由基Inayama等[16]證實，在RE→BE的惡變過程中，丙二醛、谷胱甘肽水平和超氧化物歧化酶活性發(fā)生變化，說明氧自由基或許參與RE的發(fā)展過程。大鼠RE實驗證實，食管組織病變越嚴重，超氧化物歧化酶活性越低，丙二醛水平越高；皮下注射超氧化物歧化酶3 mg/kg可使食管炎明顯減輕，食管組織超氧化物歧化酶活性升高，丙二醛水平明顯下降[17]。由此推斷，氧自由基在食管炎癥氧化代謝的發(fā)展過程中起到了十分重要的作用，而超氧化物歧化酶對于治療RE或許具有一定的意義。

3.1.4前列腺素/環(huán)加氧酶(cyclooxygenase,COX)前列腺素是一種重要的細胞生長和調(diào)節(jié)因子，在保持胃腸道黏膜完整性和調(diào)節(jié)各種功能方面起重要的作用，其中前列腺素E最為有效[18]。COX是花生四烯酸代謝合成前列腺素的限速酶，COX至少有COX-1(結(jié)構(gòu)型)和COX-2(誘導(dǎo)型)2種同工酶異構(gòu)體；生理狀態(tài)下絕大部分組織細胞不表達COX-2,而在炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下受炎性刺激物、損傷、有絲分裂原和致癌物質(zhì)等促炎遞質(zhì)誘導(dǎo)后,呈表達增高趨勢,參與多種病理生理過程[19]。Nagahama等[20]通過吲哚美辛誘導(dǎo)構(gòu)建了RE模型，研究表明，COX-1/前列腺素E2參與了食管炎黏膜防御，L-丙氨酸和L-谷氨酰胺可加重食管炎損害，而L-精氨酸和甘氨酸則起保護作用，這可能與前列腺素和一氧化氮介導(dǎo)作用有關(guān)。Hashimoto[21]通過食管十二指腸吻合術(shù)建立慢性食管炎模型，然而經(jīng)過40周的觀察，十二指腸內(nèi)容物反流進入食管引起了食管癌，COX-2和p53在食管癌中高表達。在RE食管組織中，COX-2表達和前列腺素E2水平均較正常大鼠明顯增高[22]。COX-2參與了RE的發(fā)展過程，在 RE→BE→食管腺癌的發(fā)展過程中逐漸增強[14]，說明前列腺素/COX水平可以在一定程度上提示RE病變的發(fā)展情況。

3.1.5雌激素雌激素對許多器官具有抗炎活性，有學者在RE臨床病例的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，男性較女性患病率高[23]，但也有學者證實臨床原發(fā)性RE特征與性別不相關(guān)[24]。而國外一項以絕經(jīng)前后婦女為對象的研究證實，性激素水平變化不會引起長期胃食管反流病[25]。臨床病例出現(xiàn)這種差異的原因可能與地域、信息來源、生活習慣、某些特殊基因等有關(guān)。Masaka等[26]首次研究證實，在大鼠中RE存在性別差異，在食管炎發(fā)生早期，雌激素是由雌激素受體信號介導(dǎo)，進而引起炎性介質(zhì)釋放從而發(fā)揮抗炎活性，食管肥大細胞等免疫細胞可能參與了食管炎發(fā)生的免疫調(diào)節(jié)過程。該研究為食管炎的相關(guān)研究提供了參考，但相關(guān)分子機制還有待深入研究。

3.1.6白細胞介素(interleukin，IL)IL家族很多成員結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)明確，在免疫細胞的活化、增殖、分化以及炎癥反應(yīng)中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用。RE模型大鼠的血漿IL-1β和IL-6α明顯增加，非選擇性抑制劑(吲哚美辛)和選擇性抑制劑(COX-1 抑制劑SC-560，COX-2抑制劑塞來昔布)可增強這種效應(yīng)[27]。IL-17在風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腸道炎癥、銀屑病、肺部感染、哮喘、器官移植、腫瘤發(fā)生等多種自身免疫病的發(fā)生中起關(guān)鍵性的作用[28-29]。RE組織中IL-23p19和IL-17信使RNA的表達水平和IL-17蛋白水平高于正常組織，推斷IL-23/IL-17軸是參與RE發(fā)病的細胞因子，為免疫治療提供了新的靶點[28]。

3.1.7熱激蛋白27在臨床和動物模型研究中，熱激蛋白27基因在胃食管反流病的表達情況曾存在爭議。Zheng等[30]研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白27信使RNA水平與大鼠RE病變程度密切相關(guān)，并且與刺激時間有關(guān)；與對照組比較，建立模型7 d后食管組織熱激蛋白27信使RNA的表達水平?jīng)]有差異，而14 d 后顯著高于對照組。由此推斷，食管組織在較低水平反流持續(xù)刺激下，熱激蛋白27信使RNA的表達提高。這項研究的結(jié)果或許為熱激蛋白27基因與RE相關(guān)領(lǐng)域研究提供了新的思路。

3.2RE相關(guān)的信號通路

3.2.1Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路是由Wnt、β-cat、Dvl、Axin、CK1、GSK3、APC及βTrCP等多種蛋白組成的復(fù)雜信號通路，參與胚胎干細胞分化和成人組織的自我更新過程，與結(jié)腸癌、毛囊癌、白血病、骨質(zhì)增生等多種疾病的發(fā)展密切相關(guān)[31-33]。Wnt通路抑制劑Dickkopf-1在RE組織食管黏膜轉(zhuǎn)錄和翻譯水平過表達[34]。Wnt信號通路通常在尚未化生的BE組織中不被激活，在異型增生的BE和食管腺癌中被發(fā)現(xiàn)激活[35]，提示W(wǎng)nt/β聯(lián)蛋白通路可能存在與RE有關(guān)的調(diào)控機制。

3.2.2磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括PI3K、Akt、TSC1/2及mTOR等分子，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、凋亡和分化等功能。Rafiee等[36]研究證實，pH 4.5的酸性環(huán)境能顯著提高人食管微血管內(nèi)皮細胞Akt的磷酸化水平，誘導(dǎo)熱激蛋白27信使RNA表達增加，致熱激蛋白27蛋白水平升高。在RE和BE中，Akt、p-Akt、p-mTOR的表達均比正常對照組顯著升高；PI3K可以通過激活鈣黏蛋白E調(diào)節(jié)細胞的連接，通過這種連接可以調(diào)節(jié)細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)腸上皮細胞的分化；Akt在正常食管→RE→BE→異型增生→食管腺癌中異常激活，而且其激活水平與疾病的階段密切相關(guān)[37]。

3.2.3細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路中最重要的一條。ERK1/2 信號通路的活化在RE和BE的發(fā)生過程中具有重要的作用。在正常食管鱗狀上皮→RE→BE中，ERK1/2、p-ERK1/2和周期蛋白E表達均逐漸增高；在通過食管十二指腸吻合構(gòu)建的動物模型中，ERK1/2蛋白在酸和膽汁混合反流的情況下活化，ERK1/2過表達，p-ERK1/2 通過MAPK信號通路進入細胞核內(nèi)，引起細胞增殖失控，凋亡受阻，進而正常食管鱗狀上皮細胞向BE腸化細胞轉(zhuǎn)化；胃液和十二指腸液32周的反流作用激活了Ras/ MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，ERK信號通路的重要底物周期蛋白E的過表達引起正常細胞周期紊亂、增殖和凋亡失控，導(dǎo)致正常食管向BE的發(fā)展[38]。

3.2.4叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box transcription factor O，F(xiàn)OXO)/核因子κB/腫瘤壞死因子α信號通路FOXO是Forkhead家族中的重要成員，F(xiàn)OXO亞家族在動物生長發(fā)育、細胞分化、代謝凋亡和免疫等多方面具有重要的生理學意義，胃腸道主要表達的是FOXO4[39]。FOXO4通過作用于核因子κB轉(zhuǎn)錄因子抑制腫瘤壞死因子α，從而對組織的炎癥起保護作用；在RE模型中，食管組織病理損傷程度與核因子κB和腫瘤壞死因子α信使RNA的表達呈正相關(guān)，與FOXO4 信使RNA的表達呈負相關(guān)[39-40]。

4小結(jié)

目前國內(nèi)外RE的實驗動物模型多通過手術(shù)的方式建立。手術(shù)創(chuàng)傷、易發(fā)感染等因素對實驗設(shè)施和研究團隊提出了更高的要求。對RE相關(guān)細胞因子及信號通路領(lǐng)域的研究是新藥靶點發(fā)現(xiàn)、新藥篩選的必經(jīng)之路，對于臨床療效評估及病變危險性監(jiān)測也有重要的指導(dǎo)意義。近年來，TD-8954等以5-HT受體亞型為靶點的藥物得到開發(fā)者的青睞[41-43]。然而，激動不同的5-HT亞型受體，可具有心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等不同藥理作用。而在新藥開發(fā)前期，新化合物的多靶向性引起的潛在的不良反應(yīng)同樣值得警惕。

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Research Progress on Reflux Esophagitis—Model Establishment and PathogenesisLINXiao-dong1,2,HANJuan3,CHENGYan-ling1.(1.ShandongAcademyofPharmaceuticalSciences,ShandongProvincialKeyLaboratoryofChemicalDrug,Jinan250101,China； 2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ShandongUniversity,Jinan250012,China； 3.DepartmentofCardiothoracicSurgery,ShandongProvincialHospital,Jinan250101,China)

Abstract:Reflux esophagitis(RE)is a common clinical esophageal mucosal inflammatory lesions,closely related to functional disorder of lower esophageal sphincter and gastrointestinal reflux liquid stimulation.However, the mechanism of RE is not clear, which occurrence may be mediated by the immune factor and related to oxidative stress, chemical damage. Its development is possibly regulated by Wnt/β-catenin,PI3K/Akt,ERK1/2 signaling pathway. Studies on the pathogenesis of RE make sense to provide practical reference and theoreticalbasis for evaluation, new drug screening and clinical treatment.

Key words:Reflux esophagitis; Model research; Cytokines; Signal pathway; Pathogenesis

收稿日期：2014-08-05修回日期：2014-10-29編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.11.037

中圖分類號：R571

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)11-2022-04