李美波，顧生玖，趙文鵬，朱開梅

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004)

紫杉醇長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體對Lewis肺癌移植瘤的抑制作用*

李美波，顧生玖，趙文鵬，朱開梅

(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004)

目的 研究紫杉醇長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體(PLTL)對Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。方法 建立小鼠Lewis肺癌模型，將40只荷瘤鼠隨機(jī)分為5組，空白對照組、模型對照組、紫杉醇注射液(PTX)組、紫杉醇熱敏脂質(zhì)體(PTL)組和PLTL組，每組8只?？瞻讓φ战M和模型對照組注射0.9%氯化鈉溶液，PTX組、PTL組和PLTL組，每只小鼠給藥總劑量為紫杉醇20 mg·kg-1，采用0.9%氯化鈉溶液稀釋，每次注射0.2 mL。除空白對照組外，其他組給藥后5 min內(nèi)立即將小鼠的腫瘤部位固定于(42±0.5)℃的恒溫水浴中加熱30 min。治療期間觀察移植瘤體生長情況，蘇木精-伊紅(HE)染色檢測腫瘤組織的病理學(xué)形態(tài)改變，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡率，考察PLTL聯(lián)合局部熱療對小鼠腫瘤的抑瘤作用。結(jié)果 模型對照組、PTX組、PTL組和PLTL組抑瘤率分別為21.81%，48.87%，57.22%和78.87%，腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，腫瘤組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，PLTL組腫瘤細(xì)胞凋亡與壞死數(shù)量明顯增多。結(jié)論 PLTL與PTX，PTL比較，具有明顯的熱敏靶向性，與局部熱療相結(jié)合顯著提高紫杉醇的治療效果。

紫杉醇；脂質(zhì)體，熱敏，長循環(huán)；癌，肺

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率與病死率均居第一位[1]，因此肺癌仍然是全世界面臨的公共健康問題。《2012中國腫瘤登記年報》顯示[2]，我國肺癌病死率居惡性腫瘤首位。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種抗腫瘤藥物，其對卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌[3]等多種腫瘤有良好的治療效果[2]，現(xiàn)已成為多種惡性腫瘤治療的首選藥。然而，由于紫杉醇不溶于水及多種藥用溶媒，目前市售紫杉醇注射液均采用由聚氧乙基蓖麻油和無水乙醇組成的混合溶媒，而聚氧乙基蓖麻油對人體具有多種毒性并引發(fā)部分患者嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)，因而使紫杉醇注射液的應(yīng)用受到限制。脂質(zhì)體是一種新型藥物載體，它具有改善藥物溶解性，延長藥物半衰期，提高藥物靶向性和降低藥物毒副作用等優(yōu)點[4]。為解決紫杉醇的溶解性和毒副作用問題，提高藥物作用療效，筆者將紫杉醇制備成長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體，并將其作用于Lewis肺癌荷瘤小鼠，評價其體內(nèi)的抗癌療效。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原體(specific pothogen free,SPF)級C57BL/6小鼠40只，雌性，體質(zhì)量(19±2)g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(桂)2013-0001號。動物自由飲水、進(jìn)食。

1.2 細(xì)胞株 Lewis肺癌細(xì)胞株購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫。

1.3 試劑與儀器 紫杉醇(桂林暉昂生化藥業(yè)公司，批號：JF20100304)；紫杉醇注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：13012111)；紫杉醇長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體(PLTL，由本實驗室采用薄膜分散法制備，包封率約95%，粒徑分布在80～133 nm)；紫杉醇熱敏脂質(zhì)體(PTL，由本實驗室采用薄膜分散-過膜法制備，包封率約97%，粒徑分布在84～127 nm)；胎牛血清(Hyclone，批號：NXA0544)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批號：NYG0923)；Annexin V 凋亡試劑盒(eBioscience，批號：E09656-1649)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FCM(Becton Dickinson，美國)；電子數(shù)顯卡尺(北京量具刃具廠)；光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS BX51)。

1.4 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株的培養(yǎng) Lewis肺癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞半貼壁生長，每2 d換培養(yǎng)液1次，3～4 d傳代1次。

1.5 Lewis肺癌荷瘤腫瘤模型的建立 取對數(shù)生長期Lewis細(xì)胞，用0.25%胰酶溶液消化，用不含血清的培養(yǎng)液吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個·mL-1，于小鼠右后肢靠背部皮下注射細(xì)胞懸液，每只接種0.2 mL。

1.6 小鼠分組和給藥方法與體內(nèi)抑瘤實驗 待小鼠腫瘤直徑達(dá)到8 mm時(記為第0天)，選取瘤體積一致的荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為空白對照組(注射0.9%氯化鈉溶液)、模型對照組(注射0.9%氯化鈉溶液+加熱)、PTX組(注射紫杉醇注射液+加熱)、PTL組(注射PTL+加熱)和PLTL組(注射PLTL+加熱)，給藥總劑量20 mg·kg-1。給藥前各組小鼠均腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉，然后尾靜脈注射給藥，給藥后5 min內(nèi)，除空白對照組外，其他組立即將小鼠腫瘤部位固定于42 ℃水浴中加熱20 min，每隔2 d治療1次，共治療3次。治療期間每天觀察小鼠生存狀態(tài)、測量腫瘤的長短徑，計算腫瘤的體積(V)，V=1/2長徑×短徑2(單位：mm3)，繪制腫瘤生長曲線。并于第9天處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織稱定質(zhì)量，計算抑瘤率，抑瘤率(%)=(1-治療組瘤質(zhì)量/空白對照組瘤質(zhì)量)×100%。

1.7 腫瘤組織蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色 第9天處死動物，取一部分新鮮的腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液固定，組織脫水，蠟塊包埋，病理切片，經(jīng)梯度乙醇脫蠟、染色、中性樹膠封固，顯微鏡觀察并采集圖像。

1.8 組織流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞凋亡 第9天處死動物后取新鮮腫瘤組織，研磨，濾過，冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，棄上清液，冷PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r·min-1，5 min)。1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞(1×106個·mL-1)，加入AnnexinV-FITC 5 μL，輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育20 min，然后加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 μL后輕輕混勻，于2～8 ℃避光條件下孵育5 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，進(jìn)行細(xì)胞凋亡率分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存狀態(tài)、腫瘤體積生長曲線以及抑瘤率結(jié)果 在小鼠尾源靜脈給藥的過程中，PLTL組和PTL組小鼠與注射0.9%氯化鈉溶液小鼠一樣，無不良反應(yīng)，PTX組的小鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)差、萎靡不振、毛色晦暗、飲食活動明顯減少、易激惹躁動等癥狀，且該組動物在給藥后3～4 d內(nèi)出現(xiàn)食欲不振及體質(zhì)量減輕等不良反應(yīng)。說明紫杉醇納米脂質(zhì)體劑型能明顯降低紫杉醇毒副作用。各組小鼠的腫瘤生長曲線(圖1)，經(jīng)3次治療后，除空白對照組外，其余各組腫瘤生長均受到不同程度抑制，PTX組腫瘤體積幾乎保持不變，而PTL組及PLTL組腫瘤體積開始緩慢下降，與空白對照組比較，其他4組均顯示腫瘤的生長受到抑制，但PLTL組抑瘤效果最佳。各組小鼠腫瘤體積、瘤質(zhì)量及抑瘤率見表1，模型對照組、PTX組、PTL組和PLTL組均有較明顯的抑瘤作用。PTL組的抑瘤率高于PTX組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而PLTL組抑瘤率明顯高于其余4組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可見PLTL結(jié)合熱療可顯著提高紫杉醇抗腫瘤效果。

2.2 腫瘤組織形態(tài)學(xué) 結(jié)果見圖2。5組腫瘤細(xì)胞保留腫瘤細(xì)胞特有的異型性，核大深染，核異型，核細(xì)胞質(zhì)比例高；模型對照組及其他給物組圖中見凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂，凋亡小體形成；凋亡細(xì)胞周圍可見淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，數(shù)量表現(xiàn)為模型對照組、PTX組、PTL組及PLTL組依次增多，各組腫瘤均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壞死現(xiàn)象，其中PLTL組腫瘤細(xì)胞廣泛壞死，核碎裂溶解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失(圖2E)，而PTL組可見部分腫瘤細(xì)胞核碎裂、固縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失以及片狀壞死灶(圖2D)，PTX組可見灶性壞死灶(圖2C)。

與空白對照組比較，*1P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05；與PTX組比較，*3P<0.05；與PTL組比較，*4P<0.05

Compared with blank control group，*1P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05；compared with PTX group，*3P<0.05；compared with PTL group，*4P<0.05

2.3 細(xì)胞凋亡結(jié)果 應(yīng)用FCM術(shù)對活體腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，腫瘤細(xì)胞凋亡結(jié)果(圖3)?？瞻讓φ战M、模型對照組、PTX組、PTL組及PLTL組細(xì)胞凋亡率分別為(9.4±2.0)%，(20.4±4.2)%，(42.7±3.8)%，(54.6±2.9)%和(69.7±5.0)%，與空白對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=732.793，P=0.000)，PTL組和PLTL組與PTX組比較也差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，PTL組和PLTL組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，該結(jié)果同以上腫瘤質(zhì)量和抑瘤率的結(jié)果一致。

3 討論

熱療是腫瘤治療中一種輔助療法，主要是利用腫瘤細(xì)胞對高溫較敏感，通過對機(jī)體局部加溫而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，腫瘤組織局部加熱39～42 ℃可使腫瘤組織血管閉塞和出血[5]，因此局部區(qū)域高熱也是一個有用的輔助治療，可增加藥物的運(yùn)輸和靶向藥物的蓄積。本實驗中模型對照組與空白對照組相比均表現(xiàn)出較好的抑瘤效果，腫瘤質(zhì)量抑瘤率為21.8%，流式檢測凋亡細(xì)胞結(jié)果為(20.4±4.2)%，與空白對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義，HE切片也顯示凋亡細(xì)胞與點狀壞死灶增多。

熱敏脂質(zhì)體聯(lián)合局部熱療可明顯增強(qiáng)化療藥的抗腫瘤療效[6]，本研究也證實紫杉醇熱敏脂質(zhì)體聯(lián)合局部熱療可增加靶向性，增強(qiáng)抗癌療效，實驗中PTL組抗腫瘤效果優(yōu)于PTX組。長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體不僅具有熱敏特性，還可延長在體內(nèi)循環(huán)時間，達(dá)到長循環(huán)的目的[7]。本實驗證實紫杉醇長循環(huán)熱敏脂質(zhì)體聯(lián)合局部熱療能明顯抑制Lewis肺癌荷瘤鼠移植瘤的生長。PLTL組的腫瘤質(zhì)量抑瘤率和腫瘤細(xì)胞凋亡率均明顯高于PTL組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，充分體現(xiàn)長循環(huán)特性，主要因為PEG修飾脂質(zhì)體降低了RES對藥物的吞噬，降低脂質(zhì)體的血液清除率，延長PLTL在血液中的循環(huán)時間，增加藥物與腫瘤組織的接觸機(jī)會[8]。

化學(xué)治療藥物毒副作用較大，本次實驗中PTX組小鼠治療后出現(xiàn)精神萎靡、毛色暗淡等癥狀，PTX組和PTL組體質(zhì)量下降也較PLTL組明顯，可見PLTL的毒副作用相對較低。

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DOI 10.3870/yydb.2015.06.006

Inhibitory Effect of Paclitaxel Long-circulating Thermo-sensitive Liposome on Lewis Lung Cancer Cells in Mice

LI Meibo, GU Shengjiu, ZHAO Wenpeng, ZHU Kaimei

(SchoolofPharmacy,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China)

Objective To observe the effect of paclitaxel long-circulating thermo-sensitive liposome (PLTL) on inhibiting the growth of transplanting Lewis lung cancer cells in C57BL/6 mice. Methods The model of mice carried Lewis lung cancer was established.40 tumor-bearing mice were divided into five groups randomly: blank control group, model control group, PTX group, PTL group and PLTL group, 8 mice for each group.The blank control group and the model control group were injected with 0.9% sodium chloride solution.In PTX group, PTL group and PLTL group, the dose of per injection was calculated with the reference of PTX for 20 mg·kg-1, diluted with 0.9% sodium chloride solution, and the mice were injected via the tail vein with a volume of 0.2 mL each time.Except for the blank control group, 5 minutes after administration, the tumors of the other groups were subjected to local hyperthermia at (42±0.5) ℃ for 30 min.During the treatment period, transplantation tumor growth was observed； pathological morphology changes of tumor tissues and cells were detected by HE stain； apoptosis rate of tumor cells was determined by flow cytometry to investigate the inhibition effect of PLTL combined with local thermal therapy on the tumor. Results The inhibition rate of tumor in model control group, PTX group, PTL group and PLTL group was 21.81%, 48.87%, 57.22% and 78.87%, respectively.The apoptosis rate of tumor cells was (20.4±4.2)%, (42.7±3.8)%, (54.6±2.9)% and (69.7±5.0)%, respectively.Observed by pathology, apoptosis rate and necrosis number of tumor cells in PLTL group were significantly increased. Conclusion Compared with PTX and PTL, PLTL has an evident thermo-sensitive feature and can increase the anticancer effect of paclitaxel remarkably when combined with local hyperthermia.

Paclitaxel； Liposome, thermo-sensitive, long-circulating；Cancer, lung

2014-02-10

2014-04-18

*廣西科技攻關(guān)項目(桂科能129825-21，桂科合14123001-22)；廣西教育廳項目(201202ZD065，2013YB154)；桂林市科技攻關(guān)項目(20140105-11，20140122-5，20140105-5，20140105-6，20130103-8，20130103-9，20130113-1，2013lX080)

李美波(1985-)，女，湖北襄陽人，碩士，從事藥物抗腫瘤基礎(chǔ)研究。電話：(0)13557739982，E-mail：gllimb@163.com。

朱開梅(1967-)，女，廣西桂林人，教授，碩士，主要從事化學(xué)致病分子機(jī)制和藥物防治研究。電話：(0)18978345717，E-mail：glzkm@163.com。

R979.1；R965；R734.2

A

1004-0781(2015)06-0726-04