甘惠貞，林淑瑜，潘丹婷，楊昌云

(解放軍第180醫(yī)院藥學(xué)科，泉州 362000)

高效液相凝膠過濾色譜法測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量*

甘惠貞，林淑瑜，潘丹婷，楊昌云

(解放軍第180醫(yī)院藥學(xué)科，泉州 362000)

目的 建立高效液相凝膠過濾色譜法測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量。方法 色譜柱：凝膠柱TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流動(dòng)相：[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；檢測波長280 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果 烏司他丁的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.781 25～50.00 U(r=0.999 9)；低、中、高劑量樣品平均回收率分別為100.32%，100.17%，100.21%，RSD分別為0.633%，0.568%，0.414%(n=3)。結(jié)論 該法簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于烏司他丁的含量測定。

烏司他??；含量測定；色譜法，凝膠過濾，高效液相

烏司他丁是肝臟分泌的一種具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白，屬于人體內(nèi)源性抗炎物質(zhì)，能夠抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和粒細(xì)胞彈性蛋白酶等多種蛋白水解酶的活性，促進(jìn)酶的降解[1]。注射用烏司他丁是從新鮮人尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制藥，為糖蛋白，含有143個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量約67 000，是一種典型的Kuniz型的蛋白酶抑制藥[2]，目前臨床上廣泛應(yīng)用于急慢性胰腺炎，各種休克及各種大手術(shù)時(shí)的臟器功能保護(hù)。注射用烏司他丁在水溶液中穩(wěn)定性差，為了確保藥品的質(zhì)量，采用高效液相凝膠過濾色譜法，測定注射用烏司他丁中烏司他丁的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate3000高效液相色譜儀(戴安中國有限公司)，JA2003電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司，感量：1 mg)，PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海誠寧環(huán)保科技有限公司)，注射器，移液槍。

1.2 試藥 烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140785-201001)，注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：每瓶10萬U，批號：031304023，031308014，031309113)，乙腈(美國Fisher公司，色譜純)，磷酸二氫鈉(美國MREDA，色譜純)，磷酸氫二鈉(美國MREDA，色譜純)，水為超純化水(本院消毒供應(yīng)室提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：TSKgel G3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)；流動(dòng)相：[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)；流速0.7 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL。注射用烏司他丁的輔料為甘露醇、氯化鈉、磷酸緩沖溶液，在該色譜條件，輔料無吸收峰，不會(huì)干擾注射用烏司他丁的含量測定。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品1瓶(100 000 U)，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，避光、室溫下保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 模擬臨床使用方法實(shí)際常用濃度配制，取注射用烏司他丁1瓶(100 000 U)加入10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為母液。再取母液2 mL置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為200 U·mL-1的供試品溶液。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) ①酸破壞：按照標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備方法制備200 U·mL-1烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加鹽酸調(diào)pH<2，放置4 h后，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性。②堿破壞：加氫氧化鈉溶液調(diào)pH>10，放置4 h后，用鹽酸調(diào)pH至中性。③光照破壞：強(qiáng)光(4 500 lx)照射4 h。④加熱破壞：37 ℃水浴加熱4 h后，冷卻。分別將以上破壞后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。破壞實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。本品經(jīng)酸、堿破壞后與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖比較，都有明顯的降解產(chǎn)物生成，所產(chǎn)生的雜質(zhì)與烏司他丁分離度良好；光照、加熱破壞實(shí)驗(yàn)無新的物質(zhì)生成。因此通過專屬性實(shí)驗(yàn)可得出烏司他丁對酸、堿不穩(wěn)定。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取一定量烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋制成濃度分別為39.06，78.12，156.25，312.50，625.00，1 250.00，2 500.00 U·mL-1的溶液。在色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量U(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.253 2X-0.001 7，r=0.999 9，結(jié)果表明烏司他丁在0.781 25～50.00 U范圍內(nèi)與其峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 制備高、中、低濃度的烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 250，625，312.5 U·mL-1)各3份，同日測定并連續(xù)測定5 d，計(jì)算峰面積，得高、中、低濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為0.83%，0.61%，0.46%；日間精密度RSD分別為0.63%，0.70%，0.59%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批(批號：031304023)樣品，按照“2.2.2”供試液制備方法制備200 U·mL-1烏司他丁供試品溶液6份，進(jìn)樣，測得峰面積 RSD=0.51%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的注射用烏司他丁(批號：031304023)，精密稱定，加溶劑溶解制成烏司他丁含量為 200 U·mL-1的溶液，分成 3 組，分別精密加入3種劑量烏司他丁標(biāo)準(zhǔn)品，制成濃度分別為360，400，440 U·mL-1的樣品溶液，取 20 μL進(jìn)樣，各測定3次，取平均值，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表1。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試液(批號：031304023)，分別于0，2，4，6，8，24 h進(jìn)樣分析，根據(jù)烏司他丁的峰面積計(jì)算，得RSD為0.18%(n=6)，結(jié)果表明穩(wěn)定性良好。

2.9 供試品含量測定 取3個(gè)批號的注射用烏司他丁10萬U。每個(gè)批號的藥品按照供試品溶液的配制方法進(jìn)行配制成2 00 U·mL-1的溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定，分別測定5次。含量測定結(jié)果顯示(表2)，3個(gè)批號樣品烏司他丁含量分別相當(dāng)于標(biāo)示含量的100.16%，101.04%，100.55%，均達(dá)到藥品含量的要求。

3 討論

參考2010年版《中華人民共和國藥典》[3]，烏司他丁及有關(guān)物質(zhì)的含量測定方法采用分子排阻色譜法，使用凝膠色譜柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)，以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉6.90 g、磷酸氫二鈉 17.91 g及氯化鈉8.77 g，加水800 mL溶解，調(diào)節(jié)pH為6.8，加水至1 000 mL)為流動(dòng)相，流速為0.7 mL·min-1，檢測波長為280 nm。理論板數(shù)按烏司他丁峰計(jì)算不低于800。本品為大分子多肽類糖蛋白，因此需選擇適用于分離本品的凝膠色譜柱TSKgelG3000SWxl(7.8 mm×300 mm，5 μm)。參考近年來有關(guān)凝膠色譜柱實(shí)驗(yàn)的相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，所使用的磷酸鹽濃度均較低，且加入一定量乙腈，在《中華人民共和國藥典》測定方法的基礎(chǔ)上調(diào)整磷酸鹽濃度及其與有機(jī)溶劑的比例，最終以[0.001 mol·L-1磷酸二氫鈉-0.001 mol·L-1磷酸氫二鈉(39：61)]-乙腈(90：10)為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。烏司他丁的峰寬從1.439 min下降至0.203 min，柱效從904提高至23 181。凝膠色譜柱所承受的壓力不宜過大，流速減小可降低柱壓，而流速過小，保留時(shí)間過長亦不適宜，兼顧兩方面因素，選擇0.5，0.7 mL·min-1進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明流速選擇為0.7 mL·min-1較為適宜。

表2 注射用烏司他丁含量測定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可用作注射用烏司他丁的含量測定。

[1] 鄧志會(huì)，李波，肖徽，等.高效液相凝膠過濾色譜法測定沙蠶金屬蛋白酶的純度[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32(21)：3505.

[2] 陳漢明，鄭偉鋼.烏司他丁對ALI/ARDS患者療效分析[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2013，15(1)：57-58.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：64-65.

[4] 褚良，張哲.鹽酸頭孢替安酯的聚合物檢查方法的建立與驗(yàn)證[J].哈爾濱醫(yī)藥，2012，32(3)：171-172.

[5] 王成剛，周立春，王俊秋.高效分子排阻色譜法分析注射用頭孢噻吩鈉中的高分子雜質(zhì)[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(5)：340-342.

DOI 10.3870/yydb.2015.06.031

2014-02-12

2014-07-17

*醫(yī)院基金課題項(xiàng)目(11D3007)

甘惠貞(1973-)，女，福建漳州人，主管藥師，學(xué)士，研究方向：藥房管理。電話：0595-28919451，E-mail：13599220436@139.com。

楊昌云(1973-)，男，江西萍鄉(xiāng)人，副主任藥師，學(xué)士，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0595-28299531，E-mail：yidalsy2005@163.com。

R982；R927.2

B

1004-0781(2015)06-0814-03