張生生,閆靜芳,陸兆新,王昱灃

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

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肽類生物表面活性劑中消泡劑的分離研究

張生生,閆靜芳,陸兆新,王昱灃*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

本研究首次建立硅膠柱層析兩步法以去除抗菌脂肽粗品中所含有的大豆油消泡劑成分,實驗中采用高效液相色譜(HPLC)檢測抗菌脂肽的含量,薄層色譜-可見光分光光度法定量分析消泡劑中甘油三酯含量,TLC法篩選大豆油的洗脫流動相。研究結(jié)果表明:使用200～300目的硅膠作為層析材料,硅膠的總負(fù)載量為12.5mg/g時,采取混合液(石油醚∶乙酸乙酯∶乙酸=20∶2∶1,體積比)為流動相,以1mL/min流速進(jìn)行洗脫,可將97.97%的大豆油成分去除;第二階段采用流動相為100% 的乙醇以1mL/min流速進(jìn)行洗脫可將抗菌脂肽解吸,抗菌脂肽的總回收率達(dá)到91.52%,純度從34.07%提高到93.12%。本研究為肽類生物表面活性劑工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

硅膠,柱層析,生物表面活性素,消泡劑,分離

抗菌脂肽是一類由β-胺基脂肪酸和肽以酰胺鍵結(jié)合小分子物質(zhì)[1],同時具有親水和親油的分子基團(tuán),是一種兩親型的物質(zhì)[2]?？咕牡闹饕N類有Surfactin、Iturin、Fengycin等[3],生產(chǎn)菌為革蘭氏芽孢桿菌,合成則是以非核糖體的方式進(jìn)行[4-7]。surfactin的分子由一個C(13～15)的脂肪酸鏈與一個由七個氨基酸構(gòu)成的多肽環(huán)以酰胺鍵的形式結(jié)合而成,脂肪酸鏈的極性較弱易于與一些非極性強(qiáng)的物質(zhì)結(jié)合,而由氨基酸構(gòu)成的多肽環(huán)則易于與一些極性強(qiáng)的物質(zhì)結(jié)合,分子量約為1000。surfactin具有比一般的生物活性物質(zhì)更加特別的生物活性,利用其特別的分子結(jié)構(gòu)也能夠?qū)崿F(xiàn)與非雙親分子的分離。

抗菌脂肽surfactin作為生物表面活性劑,在目前所有的生物表面活劑中活性是最強(qiáng)的,而且相較于化學(xué)合成的表面活性劑,具有易降解、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn),是表面活性劑未來的發(fā)展趨勢[8]。它能在很高水平上促進(jìn)原油的分解,對原油污染地區(qū)的土壤生態(tài)恢復(fù)過程起到非常明顯的作用[9-10]。研究還發(fā)現(xiàn),surfactin能夠有效地抑制真菌和細(xì)菌、病毒等的生長[11],具有高效、不易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點(diǎn),可以用作代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的新型抗生素在醫(yī)藥行業(yè)中廣泛使用。

Surfactin能夠在20μmol/L的濃度下將其水溶液的表面張力降到最低,因此當(dāng)有空氣存在的情況下極易產(chǎn)生大量的泡沫[12-13]。現(xiàn)階段surfactin的生產(chǎn)過程由于培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)豐富,并在發(fā)酵過程中大量通氣,導(dǎo)致在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生豐富的泡沫。這樣不僅造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失,還會增加生產(chǎn)成本[14-16],不利于surfactin的廣泛應(yīng)用。在surfactin發(fā)酵中加入大豆油作為消泡劑,能夠有效地抑制發(fā)酵過程中泡沫的產(chǎn)生,并極大地提高了抗菌脂肽產(chǎn)量[17]。但經(jīng)過預(yù)處理的抗菌脂肽樣品中仍殘留著難以分離的大豆油成分,surfactin是兩親性分子,疏水基會與大豆油中的甘油三酯大量結(jié)合,造成兩者分離困難、surfactin進(jìn)一步喪失抗菌和表面活性,其純化和應(yīng)用受到影響。為了人們的身體健康和食品醫(yī)藥的安全性,現(xiàn)代醫(yī)藥和食品產(chǎn)業(yè)對物質(zhì)純度的要求很高,因此為了擴(kuò)大surfactin的應(yīng)用范圍,有必要對抗菌脂肽粗品進(jìn)行進(jìn)一步的純化,去除其中殘留的消泡劑成分,使其達(dá)到醫(yī)藥和食品行業(yè)的要求。關(guān)于抗菌脂肽發(fā)酵液中消泡劑成分的分離脫除研究至今未見相關(guān)研究報道。

硅膠柱層析是一種常見的分離方法,操作簡單、成本低廉,在工業(yè)化生產(chǎn)中已經(jīng)應(yīng)用成熟。本實驗以硅膠柱層析作為主要手段,首次采取兩步法對發(fā)酵樣品中的消泡劑(大豆油)進(jìn)行分離。經(jīng)過對硅膠柱層析條件優(yōu)化的過程,確定了硅膠柱層析二步法分離去除抗菌脂肽發(fā)酵液中消泡劑的最佳條件,為肽類生物表面活性劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淀粉液化芽孢桿菌fmb50 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實驗室構(gòu)建與保藏。

消泡劑 金龍魚精煉一級大豆油;柱層析硅膠(200～300目,工業(yè)級) 青島海洋化工廠;G型薄層層析硅膠板(10cm×20cm) 青島海洋化工廠;石油醚,乙酸乙酯、氯仿、乙醇、濃氨水(分析純) 南京試劑廠;乙腈、三氟乙酸(色譜純) 德國Merck公司。

玻璃層析柱1.1cm×30cm 上海煊盛生化科技有限公司;雙槽展開缸20cm×10cm 上海信誼儀器廠;恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;DBS-100電腦全自動部分收集器 上海滬西儀器設(shè)備廠;CP-114先行者精密電子天平 美國OHAUS公司;SB5200DT超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司;V-5000分光光度計 上海元析儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Aglient公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌脂肽的制備 抗菌脂肽的粗品制備過程通過發(fā)酵的方式進(jìn)行,如圖1所示主要有保藏菌種斜面的活化及種子液的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)基的接種、產(chǎn)生surfactin的發(fā)酵過程等步驟。

圖1 抗菌脂肽的發(fā)酵過程Fig.1 The fermentation progress of antimicrobial lipopeptides

每1L的發(fā)酵液中殘留0.15mL的大豆油,發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理后得到抗菌脂肽粗品,然后溶于1mL氯仿中,經(jīng)檢測此時樣品純度為34.07%,混勻即可進(jìn)樣。

1.2.2 薄層色譜法確定柱層析大豆油洗脫的流動相 薄層色譜法的展開劑可以直接應(yīng)用于硅膠柱層析。硅膠G板首先在110℃的烘箱中活化30min,設(shè)置一系列的石油醚與乙酸乙酯的比例(設(shè)置見表1),使用微量進(jìn)樣針吸取5μL的大豆油石油醚稀釋溶液點(diǎn)于硅膠板上,每個板點(diǎn)九個平行樣。使用不同展開劑展開后,將硅膠板置于碘缸中蒸5min,觀察顯色情況。計算比遷移率Rf值,取每組的平均值。然后以確定的展開劑對經(jīng)過預(yù)處理后的surfactin樣品進(jìn)行展開,將展開后的硅膠板置于一個大燒杯中,再放入一個裝有2mL濃鹽酸的小燒杯,以保鮮膜對大燒杯進(jìn)行密封后(應(yīng)保證在酸解過程中保鮮膜不會因濃鹽酸的揮發(fā)而破裂),置于110℃烘箱中,進(jìn)行原位酸解[18]。酸解后的板以茚三酮溶液染色,與以相同方式展開,與未酸解的硅膠板進(jìn)行對照,以確定在該流動相下,surfactin是否會被提前洗脫下來。

1.2.3 大豆油甘油三酯定量分析方法的建立 大豆油中的主要成分是甘油三酯,其含量達(dá)97%,本實驗中以甘油三酯作為大豆油定量分析的指標(biāo),來確定大豆油的洗脫效果,因而需要對洗脫液中的甘油三酯含量進(jìn)行測定。薄層色譜-分光光度法[19]因其操作簡單、結(jié)果可靠,在本實驗中被采用。稱取40g 200～300目的硅膠,進(jìn)樣1mL大豆油,使用上面方法確定的流動相進(jìn)行洗脫,薄層色譜確定洗脫液中是否只含有甘油三酯。然后將只含有甘油三酯的洗脫液合并,濃縮得到高純度的甘油三酯樣品,經(jīng)過薄層色譜檢測后,可作為甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品使用。配制5、10、15、20mg/mL等一系列質(zhì)量濃度的甘油三酯石油醚溶液,使用微量進(jìn)樣針取5μL樣品點(diǎn)在硅膠板上,展開后,待展開劑揮發(fā),以10%的磷鉬酸乙醇溶液沾板方式染色,吹干溶劑,再置于105℃烘箱中顯色10min。將顯色后的硅膠板置于濃氨水上方去除背景色,然后扣取顯色的斑點(diǎn),以2mL的純凈水浸泡,并超聲沉淀30min,待扣取的硅膠板固體成分沉淀后,取上清定容到5mL。在700nm處測定稀釋液的吸光值,吸光值與甘油三酯的含量成正比關(guān)系,可以得到甘油三酯質(zhì)量濃度與其吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 硅膠柱層析 首先稱取8g 200～300目的硅膠,置于110℃的烘箱中活化3h后,以石油醚浸泡過夜。裝柱前,層析柱中先加入0.1BV的石油醚,然后倒入浸泡過的硅膠,待自然沉降過程完成,以石油醚淋洗硅膠柱,壓實柱體,并洗脫出硅膠柱中的雜質(zhì)。進(jìn)樣前以洗脫大豆油的流動相替換出柱體中的石油醚。加入配制好的樣品后,泵入初始流動相,通過薄層色譜法跟蹤大豆油的洗脫分布,然后將含有大豆油的洗脫液收集起來,濃縮后按照上面的方法進(jìn)行定量分析,計算大豆油的洗脫率。第二階段的洗脫以純乙醇作為流動相,HPLC跟蹤檢測[20]確定含有surfactin的乙醇溶液并收集。

表1 不同展開劑的薄層層析結(jié)果Table1 Results of TLC with different developing solvents

1.2.5 回收率及純度的測定

Surfactin回收率(%)=c1×v/(p×m1)×100

其中：c1為檢測的收集濃縮液的濃度,v為收集液濃縮后的體積,p為預(yù)處理后干物質(zhì)的純度,m1為配制樣品時稱取的干物質(zhì)的質(zhì)量。

Surfactin的純度(%)=c1×v/(m3-m2)×100

Surfactin純度測定:蒸餾水潤洗150mL燒杯后在55℃烘箱中烘至恒重,稱重m2。加入濃縮后的收集液,將溶劑吹干,在45℃烘箱中烘至恒重,稱重為m3。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 所得實驗均重復(fù)三次,數(shù)據(jù)取三次實驗結(jié)果的平均值,采用orgin8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆油甘油三酯薄層色譜法展開劑的選擇

設(shè)置一系列展開體系,展開的結(jié)果如表1所示。由表1可知,當(dāng)流動相為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1時,大豆油中各個組分能夠完全分開,但是Rf值為0.82,應(yīng)用于硅膠柱層析的展開劑的Rf值范圍一般在0.5左右,Rf值太大會導(dǎo)致組分在層析柱無法得到有效分離。以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=9∶1作為流動相時,雖然各個組分能夠分開,但是拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,這樣會導(dǎo)致在硅膠柱層析中同樣會導(dǎo)致拖尾現(xiàn)象。因而向展開體系中加入乙酸,使展開劑的最終組成為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=18∶2∶1,由表1可知,該展開體系可以有效地防止拖尾,Rf值也在0.5左右,能夠直接應(yīng)用于硅膠柱層析。以此展開劑對經(jīng)過HPLC檢測的純度達(dá)到80% surfactin樣品進(jìn)行展開,經(jīng)過原位酸解的實驗組與未經(jīng)原位酸解的對照組以10%茚三酮乙醇染色后進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),surfactin樣品在該展開劑下的比遷移值幾乎為零,這樣應(yīng)用于硅膠柱后,surfactin會被層析柱吸附,而甘油三酯會被淋洗下來,達(dá)到分離的目的。

2.2 大豆油甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以溶液中甘油三酯質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo),吸光值為橫坐標(biāo),繪制兩者之間的關(guān)系曲線,如圖2。由圖可知,甘油三酯濃度與吸光值之間的線性關(guān)系良好,回歸方程為y=236.5010x-18.8778,相關(guān)系數(shù)R2=0.9931。為后續(xù)實驗中簡單、快速的測定溶液中甘油三酯含量提供了有效的手段。

圖2 甘油三酯濃度與吸光值之間的關(guān)系曲線Fig.2 Triglyceride and the light absorbance value curve

2.3 洗脫大豆油甘油三酯流動相的選擇與驗證

硅膠層析柱洗脫時使用的流動相要比以TLC方法確定的展開劑極性稍小,所以甘油三酯洗脫時增加洗脫劑中石油醚的含量,以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=20∶2∶1為流動相。按照上述方法配制好樣品后,在1mL/min條件下層析,收集甘油三酯洗脫液,濃縮后,根據(jù)上面的定量方法進(jìn)行定量分析,經(jīng)過三次重復(fù)驗證實驗結(jié)果如表2。由表可知:三次重復(fù)實驗中甘油三酯的回收率平均值為97.97%,標(biāo)準(zhǔn)差僅為0.75%,實驗結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性良好。這說明V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=20∶2∶1作為淋洗劑,能夠有效地將過柱樣品中的大豆油成分洗脫下來。

表2 甘油三酯洗脫實驗Table2 The elutation of triglyceride

2.4 柱層析優(yōu)化

上面的驗證實驗可知:在所確定的大豆油洗脫條件下,樣品中的大豆油成分能夠有效地被洗脫和去除。因此在后續(xù)實驗中不再測定洗脫液中的甘油三酯含量。以surfactin的回收率和純度作為層析效果的評價指標(biāo)。

2.4.1 洗脫surfactin流動相的篩選 surfactin因為含有一個親水基團(tuán),具有較強(qiáng)的極性,為了能夠?qū)urfactin從層析柱上面洗脫下來,初步選用分子極性強(qiáng)的純醇做為流動相。為了更好的將surfantin從層析柱上洗脫下來,并降低成本,可以向純乙醇中加入一定比例的超純水。水的極性比乙醇更強(qiáng),水分子與surfactin爭奪硅膠的極性中心,理論上能更有效地將surfactin洗脫下來,硅膠柱實驗結(jié)果如圖3。由圖3可知乙醇中加入一定量的水在一定范圍內(nèi)能夠提高surfactin的回收率,但是流動相極性太強(qiáng)的條件下,很多強(qiáng)極性的雜質(zhì)也會隨著surfactin被洗脫下來,導(dǎo)致層析后樣品的純度降低。因此綜合考慮,單一的乙醇作為流動相操作簡單,成本也相對低廉,易于工業(yè)化的放大生產(chǎn)。使用乙醇作為流動相時,回收率與純度均處在一個較高的水平,具備易進(jìn)行工業(yè)化的潛能。

圖3 流動相對純度和回收率的影響Fig.3 Effect of fluid phase on the recovery and purity

2.4.2 最佳流速的優(yōu)化 物質(zhì)在硅膠柱層析的過程是一個吸附和解吸不斷進(jìn)行的過程,當(dāng)流動相確定后,層析時流速能夠決定層析進(jìn)行的質(zhì)量高低和整個過程的時間長短。Surfactin是一種極性較強(qiáng)的物質(zhì),硅膠柱對其吸附力較強(qiáng),因此有必要在保證樣品純度的條件下,提高流速節(jié)省時間以及回收率。經(jīng)過系列優(yōu)化實驗,結(jié)果如圖4如示。由圖可知,當(dāng)流速為0.5mL/min時,回收率處在一個較低的水平,這樣會增加surfactin的生產(chǎn)成本。流速為1.0mL/min時,surfactin的純度和回收率均較高,故選用1.0mL/min做為層析時的流速。

圖4 流速對回收率和純度的影響Fig.4 Effect of flow rate on the recovery and purity

2.4.3 上樣量的優(yōu)化 硅膠對不同物質(zhì)的吸附能力不同,在未達(dá)到飽和吸附量時,隨著進(jìn)樣量的增加,純度和回收率不會明顯降低。工業(yè)化中為了一次處理更多的樣品,節(jié)省時間和成本,上樣濃度一般會達(dá)到層析硅膠的飽和吸附量。本實驗設(shè)置四個上樣量梯度,經(jīng)過三次重復(fù)實驗結(jié)果如圖5。由圖5可知,當(dāng)硅膠層析材料為8g,干物質(zhì)的添加質(zhì)量為50mg時,實驗中損失所占比例會較大,導(dǎo)致回收率降低,增加生產(chǎn)成本,影響生產(chǎn)的效率。添加干物質(zhì)的質(zhì)量為150mg及200mg時,純度和回收率相較于添加100mg有明顯的下降。從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮,選用添加干物質(zhì)100mg(即12.5mg抗菌脂肽/g硅膠)作為最佳添加量。

圖5 上樣量對回收率和純度的影響Fig.5 Effect of quantity of dry substance of surfactin on recovery and purity

經(jīng)過對surfactin兩步層析過程流動相、流速、上樣量的優(yōu)化,層析的效率有了很大提升,surfactin樣品的回收率達(dá)到了91.52%,而純度可達(dá)到93.12%。

3 結(jié)論

本文首次以硅膠柱層析為主要手段對抗菌脂肽樣品中殘留的消泡劑大豆油成分進(jìn)行了分離脫除,并對該兩步層析法操作工藝進(jìn)行了優(yōu)化。以12.5mg抗菌脂肽/g硅膠的比例對預(yù)處理后的抗菌脂肽配制樣品,以V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)∶V(乙酸)=20∶2∶1的混合液為流動相,流速為1mL/min時,能夠?qū)l(fā)酵中所加入的97.97%消泡劑洗脫下來;再以無水乙醇為流動相,速度為1mL/min進(jìn)行第二階段層析時,surfactin樣品的回收率達(dá)到了91.52%,而純度可達(dá)到93.12%。由此可以得出結(jié)論,所建立的硅膠柱兩步層析法可有效去除surfactin中大豆油,操作工藝易實現(xiàn)工業(yè)化,為surfactin作為新型表面活性劑的生產(chǎn)和使用提供了基礎(chǔ)。

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Research of the separation of defoamer in antimicrobial lipopeptides

ZHANG Sheng-sheng,YAN Jing-fang,LU Zhao-xin,WANG Yu-feng*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agriculture University,Nanjing 210095,China)

In this study,two-step method of silica gel chromatography was established to remove the defoamer in broth of antimicrobial lipopeptides for the first time. High-performance liquid chromatography(HPLC)was applied to detect the concentration of surfactin. Thin layer chromatography(TLC)-visible spectrophotometry was used to conduct quantitative analysis of triglyceride in eluent. Also,thin layer chromatography(TLC)was taken as the way to select the developing agent for triglyceride. The result showed,when 200～300 mesh silica gel was used as the chromatography support beads,the total loading amount of silica gel was 12.5mg/g. Under the condition of the mixture(petroleum ether∶ethyl acetate∶ethyl acid=20∶2∶1,proportation of volume)as the fluid phase,flow rate of 1mL/min,97.97% of all the defoamer was obtained in the eluent. Secondly,when absolute ethyl alcohol was used as the fluid phase with a flow rate of 1mL/min,surfactin could be desorpted from the silica gel column,and its recovery reached 91.52%. The purification was greatly improved from 34.07% to 93.12%. This research provided experimental basement for the industrial production and application of antimicrobial lipopeptides.

silica gel;column chromatography;surfactin;defoamer;separation

2014-06-27

張生生(1989-),男，在讀碩士研究生,主要從事食品科學(xué)和生物發(fā)酵的研究。

*通訊作者:王昱灃(1976-),男，博士，副教授,主要從事生物分離的研究。

中央高?；緲I(yè)務(wù)專項基金(KYZ201154),江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目和江蘇省優(yōu)勢學(xué)科人才引進(jìn)項目(80900210521)。

TS201.1

A

:1002-0306(2015)09-0091-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.011