鐘紫旋,劉 麗,張 勇,羅 鋒

(西南大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院 能源生物資源開(kāi)發(fā)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400716)

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誘導(dǎo)物及種間誘導(dǎo)對(duì)白腐菌的錳過(guò)氧化物酶(MnP)的誘導(dǎo)

鐘紫旋,劉 麗,張 勇,羅 鋒*

(西南大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院 能源生物資源開(kāi)發(fā)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400716)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和不同白腐菌種間相互誘導(dǎo)兩種途徑來(lái)研究Trametesversicolor、Pleurotusostreatus、Dichomitussqualens、Bjerkanderaadusta四種白腐菌產(chǎn)MnP活性,發(fā)現(xiàn)這些白腐菌在一些誘導(dǎo)條件下可產(chǎn)生大量MnP。結(jié)果表明,外源誘導(dǎo)物中,2,5-二甲基苯胺是有效的MnP誘導(dǎo)劑,對(duì)四種菌產(chǎn)MnP均有不同程度的誘導(dǎo)作用。異丙醇能提高T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens產(chǎn)MnP活性,且誘導(dǎo)效果優(yōu)于乙醇。Cu2+能顯著提高T.versicolor和D.squalens產(chǎn)MnP活性。 Mn2+能顯著提高P.ostreatus和B.adusta產(chǎn)MnP活性。不同白腐菌相互作用時(shí),T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩共培養(yǎng)均有明顯的MnP種間誘導(dǎo)效果。本研究為大量產(chǎn)MnP并將其應(yīng)用于工業(yè)提供可能。

白腐菌,錳過(guò)氧化物酶,外源誘導(dǎo)物,種間誘導(dǎo)

白腐菌是已知的唯一具有徹底降解木質(zhì)素能力的真菌[1],這類真菌所分泌的非特異性氧化還原酶中,錳過(guò)氧化物酶(Manganese Peroxidase,MnP)對(duì)木質(zhì)素降解起著至關(guān)重要的作用。此外,MnP對(duì)許多結(jié)構(gòu)不同的高毒性、大分子、難降解的芳香族化合物具有廣泛的降解能力,包括氯苯、聯(lián)苯、苯胺、氯酚、以及硝基芳烴化合物等[2],能使這些底物經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)逐步降解為二氧化碳和其它小分子產(chǎn)物。由于MnP對(duì)植物殘?bào)w的高效生物轉(zhuǎn)化作用,它們?cè)诩垵{和造紙、食品、紡織、染料等工業(yè),生物修復(fù)等各種生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊前景[2-4]。但MnP的有限來(lái)源是制約其大量產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵難點(diǎn),因此如何獲取大量MnP成為我們面臨的直接而現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題。

誘導(dǎo)物對(duì)MnP合成及表達(dá)具有重要作用,添加合適的外源誘導(dǎo)物是增加MnP產(chǎn)量最有效的方法之一。誘導(dǎo)物不僅能誘導(dǎo)MnP產(chǎn)量增加,還起到分散劑和保護(hù)劑的作用[3,5]。雖然單一培養(yǎng)的一些白腐菌MnP降解木質(zhì)素機(jī)理已被較大程度的揭示[6],但對(duì)不同白腐菌共培養(yǎng)的生化和酶學(xué)性質(zhì)研究較少。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)白腐菌產(chǎn)MnP的研究仍主要集中于工業(yè)應(yīng)用[4,7-9],而缺乏對(duì)白腐菌產(chǎn)MnP的外源化合物誘導(dǎo)和近緣種間誘導(dǎo)研究,MnP誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚[10]。另外,誘導(dǎo)物對(duì)MnP產(chǎn)量及活性的影響也因菌種而異,不同的菌種在不同的環(huán)境條件下其產(chǎn)酶所需的最適誘導(dǎo)物及其濃度差異較大。因此本實(shí)驗(yàn)采用外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和真菌種間相互誘導(dǎo)兩種途徑來(lái)對(duì)Trametesversicolor、Pleurotusostreatus、Dichomitussqualens和Bjerkanderaadusta四株白腐菌如何大量誘導(dǎo)產(chǎn)MnP進(jìn)行初步研究。為進(jìn)一步優(yōu)化白腐菌MnP合成條件及構(gòu)建MnP超量表達(dá)的工程菌株提供理論基礎(chǔ),也為深入研究MnP誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制,將MnP廣泛應(yīng)用于工業(yè)提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Trametesversicolor(NBRC30388),Pleurotusostreatus(NBRC30776),Bjerkanderaadusta(NBRC106826) 日本生物資源保藏中心；Dichomitussqualens(DSMZ9615) 德國(guó)微生物菌種保藏中心。

恒溫?fù)u床 Thermo；全自動(dòng)高壓滅菌鍋 TOMY；立式高速冷凍離心機(jī) TOMY；UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津；冷凍搖床培養(yǎng)箱 IKA；霉菌培養(yǎng)箱 上海齊欣；干熱滅菌箱 松下。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液制備 在100mL三角瓶中裝50mL PDB培養(yǎng)基,121℃高壓蒸汽滅菌20min。再分別從培養(yǎng)好的四種菌的PDA平板中取相同大小的菌塊(直徑Φ7mm)至50mL PDB培養(yǎng)基中,于28℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)5d,轉(zhuǎn)速180r/min。用無(wú)菌勻漿器攪拌均勻,得到菌液。

1.2.2 外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)

1.2.2.1 不添加誘導(dǎo)物 以5%(v/v)的接種量接種菌液至50mL PDB培養(yǎng)基/100 mL三角瓶,搖床振蕩培養(yǎng)(28℃,180r/min),每隔48h取樣并離心(12000r/min,4℃,4 min),測(cè)定酶活,每組3個(gè)平行。

1.2.2.2 添加誘導(dǎo)物 在搖床振蕩培養(yǎng)第3d,分別添加0.1mmol/L CuSO4·5H2O,0.1mmol/L MnSO4·H2O,20g/L乙醇,20g/L異丙醇,0.5mmol/L 2,5-二甲基苯胺,0.5mmol/L 4-甲氧基苯胺,0.5mmol/L松柏醇,0.5mmol/L焦性沒(méi)食子酸,0.5mmol/L藜蘆醇,0.5mmol/L 2,6-二甲氧基酚(DMP)至上述四種真菌的PDB培養(yǎng)基中,繼續(xù)搖床振蕩培養(yǎng),以1.2.2.1作為對(duì)照。每隔48h取樣并離心(12000r/min,4℃,4min),測(cè)定酶活,每組3個(gè)平行。

1.2.3 共培養(yǎng) 分別從培養(yǎng)好的兩種菌的平板中取相同大小的兩個(gè)菌塊(直徑均為Φ7mm),接種于新的同一PDA平板上,兩菌塊間保持約4cm距離,且距平板邊緣約2cm。將該平板放在恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)7d左右(如圖4所示)。每組3個(gè)平行。從上述培養(yǎng)好的共培養(yǎng)平板中分別取中間交界線菌塊及兩種菌單獨(dú)培養(yǎng)菌塊(直徑均為Φ7mm)于2mL離心管中,并加入1mL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液,置于恒溫?fù)u床中振蕩約8h,離心(12000r/min,4℃,4min)后取上清液測(cè)定酶活。

1.2.4 MnP活力測(cè)定 愈創(chuàng)木酚法[11-12]:測(cè)定體系中含0.4mmol/L愈創(chuàng)木酚,0.1mmol/L H2O2,0.2mmol/L MnSO4,50mmol/L(pH4.5)琥珀酸鈉緩沖液。通過(guò)加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)液在465nm處吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香族化合物對(duì)MnP活性影響

MnP能夠催化芳香族化合物的氧化反應(yīng),其催化反應(yīng)過(guò)程是底物的單電子氧化,生成相應(yīng)的活性自由基[2,13-14]。同時(shí)這些芳香類底物酚氧環(huán)上不同位置的取代也影響著MnP的合成。文獻(xiàn)報(bào)道一些大分子木質(zhì)素及其亞結(jié)構(gòu)類似物是木質(zhì)素降解酶生成的有效誘導(dǎo)劑。有些研究者認(rèn)為白腐真菌受誘導(dǎo)分泌木質(zhì)素降解酶類,可能是用于從培養(yǎng)基質(zhì)中消除某些有害芳香族化合物的毒害作用,因此可以提高木質(zhì)素降解酶產(chǎn)量[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇了6種普遍使用的芳香族化合物來(lái)考察它們對(duì)T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產(chǎn)MnP活性的影響。

對(duì)四種菌產(chǎn)MnP有誘導(dǎo)現(xiàn)象的芳香族化合物如圖1所示(對(duì)相應(yīng)菌無(wú)誘導(dǎo)現(xiàn)象的誘導(dǎo)物未在圖中顯示)。結(jié)果表明,2,5-二甲基苯胺是有效的MnP誘導(dǎo)劑,對(duì)該四種菌產(chǎn)MnP均有不同程度誘導(dǎo)效果。其中,添加2,5-二甲基苯胺后,T.versicolor、D.squalens和B.adusta都在培養(yǎng)的第7d MnP活性達(dá)到最大值,分別為5.76、18.39和81.62U/L,較對(duì)照組提高了18.77倍、2.52倍和1.56倍(圖1a,b,d),而P.ostreatus在培養(yǎng)的第13d酶活達(dá)到最大值6.02U/L,較對(duì)照組提高了8.63倍(圖1b)。其次,在接種T.versicolor的培養(yǎng)基中,松柏醇的誘導(dǎo)效果最為明顯,并在培養(yǎng)的第5d酶活達(dá)到峰值13.81U/L,較對(duì)照組提高了164.80倍(圖1a)。盡管藜蘆醇是報(bào)道最多的MnP誘導(dǎo)劑,但在本實(shí)驗(yàn)中只對(duì)T.versicolor和P.ostreatus產(chǎn)MnP有一定誘導(dǎo)作用,其中對(duì)P.ostreatus的誘導(dǎo)效果最好,酶活達(dá)到峰值時(shí)為對(duì)照組的8.00倍(圖1b)。將四株菌的對(duì)照組酶活進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示B.adusta產(chǎn)MnP能力比其它菌更強(qiáng),酶活最高可達(dá)31.83U/L,且在4-甲氧基苯胺的誘導(dǎo)下,第5d酶活達(dá)130.125U/L,是所有芳香類物質(zhì)誘導(dǎo)中出現(xiàn)的最高值(圖1d)。

圖1 不同芳香族化合物對(duì)四種白腐菌MnP活性的影響Fig.1 Effect of different aromatic compound on MnP activity of four white-rot fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結(jié)果表明,芳香族化合物對(duì)四種白腐菌產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)效果較好。但隨著取代基的種類、數(shù)目和位置的不同,對(duì)于白腐菌產(chǎn)MnP活性的影響是有差異的。另外,由于菌種不同,芳香類物質(zhì)對(duì)MnP活性的影響也存在顯著差異。

2.2 乙醇和異丙醇對(duì)MnP活性影響

醇類能增加白腐菌膜的滲透性,從而促進(jìn)蛋白分泌。另外,醇類對(duì)白腐菌具有一定毒害作用,會(huì)刺激白腐菌分泌木質(zhì)素降解酶來(lái)消除其毒害作用[16]。因此本實(shí)驗(yàn)考察了乙醇和異丙醇對(duì)T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產(chǎn)MnP活性的影響。

圖2所示,在T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens培養(yǎng)基中添加異丙醇后,MnP活性明顯增加,說(shuō)明異丙醇對(duì)這三種菌具有較好的誘導(dǎo)作用(圖2a,b),其中對(duì)T.versicolor產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)效果最好,在培養(yǎng)的第9d酶活達(dá)到峰值18.29 U/L,較對(duì)照組提高了9.97倍,均高于其它芳香族化合物對(duì)該菌的誘導(dǎo)酶活。相比之下,乙醇對(duì)T.versicolor、P.ostreatus和D.squalens三種菌產(chǎn) MnP無(wú)明顯誘導(dǎo)現(xiàn)象,只有在培養(yǎng)的第5d對(duì)B.adusta產(chǎn)MnP有較好誘導(dǎo)作用,能使其最高酶活達(dá)85.06 U/L,但隨著培養(yǎng)天數(shù)增加,其酶活迅速下降,最終對(duì)該菌產(chǎn)MnP無(wú)誘導(dǎo)作用(圖2d)。

圖2 乙醇和異丙醇對(duì)四種白腐菌MnP活性的影響Fig.2 Effect of ethanol and isopropanol onMnP activity of four white-rot fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結(jié)果表明,相同濃度下,異丙醇對(duì)MnP的誘導(dǎo)效果優(yōu)于乙醇,這或許是由于異丙醇的毒性大于乙醇,且在生物體內(nèi)代謝慢,因此更易刺激白腐菌分泌MnP,從而導(dǎo)致MnP活性增加。但總體而言,醇類物質(zhì)對(duì)MnP的誘導(dǎo)作用較芳香族化合物弱。

2.3 Cu2+和Mn2+對(duì)MnP活性影響

許多研究報(bào)道顯示[5,17],除芳香族化合物外,微量金屬離子能誘導(dǎo)MnP產(chǎn)量增加,尤其是 Mn2+和Cu2+。丁少軍等人[18]在研究云芝產(chǎn)酶影響條件時(shí),發(fā)現(xiàn)添加適量Mn2+和Cu2+均能提高M(jìn)nP活性。這是由于Mn2+是 MnP活性基團(tuán)的組成部分,同時(shí)又作為MnP還原底物即電子供體,對(duì)MnP有激活作用[14]。Cu2+也被認(rèn)為與MnP活性位點(diǎn)相結(jié)合,從而對(duì)MnP有激活作用。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)Mn2+和Cu2+誘導(dǎo)作用研究較多,但只局限于部分真菌,由于不同真菌分子調(diào)控機(jī)理不同,因此該實(shí)驗(yàn)考察了Mn2+和Cu2+對(duì)T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌產(chǎn)MnP活性的影響。

圖3所示,兩種金屬離子整體上能顯著提高T.versicolor、D.squalens和B.adusta三種菌產(chǎn)MnP活性,但各自對(duì)不同菌產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)能力不同。其中,Cu2+對(duì)T.versicolor和D.squalens兩種真菌菌株產(chǎn)MnP誘導(dǎo)效果最好(圖3a,c)。由圖可知,在培養(yǎng)的第13d,Cu2+可誘導(dǎo)T.versicolor產(chǎn)MnP活性達(dá)263.98U/L,較對(duì)照組提高了49.68倍,且仍呈上升趨勢(shì)；而Mn2+卻對(duì)該菌產(chǎn)MnP無(wú)明顯誘導(dǎo)現(xiàn)象(圖3a)。另外,D.squalens培養(yǎng)基添加Cu2+后,在第11d酶活達(dá)到峰值225.79 U/L,較對(duì)照組提高了63.90倍,且比芳香族化合物最佳誘導(dǎo)酶活(18.39U/L)高出了11.28倍；此外Mn2+在該菌培養(yǎng)9d后開(kāi)始刺激了MnP產(chǎn)量,并在第13d使其酶活達(dá)106.29U/L,較對(duì)照組提高78.73倍(圖3c)。Mn2+對(duì)P.ostreatus和B.adusta產(chǎn)MnP的刺激效果也是不可忽視的,但其最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)趨勢(shì)因菌種而異。例如,添加Mn2+后,P.ostreatus在培養(yǎng)的第9d酶活達(dá)到峰值7.92U/L(圖3b)；B.adusta在第5d酶活達(dá)最高值140.21U/L,但之后呈下降趨勢(shì)(圖3d)。

圖3 Cu2+和Mn2+對(duì)四種白腐菌MnP活性的影響Fig.3 Effect of Cu2+and Mn2+on MnP activity of four fungus注：a：Trametes versicolor；b：Pleurotus ostreatus；c：Dichomitus squalens；d：Bjerkandera adusta。

結(jié)果表明,Mn2+和Cu2+能誘導(dǎo)四種白腐菌大量產(chǎn)MnP,且總體上對(duì)MnP的誘導(dǎo)效果優(yōu)于芳香族化合物,因此可對(duì)上述四種真菌中金屬離子是如何跨膜與MnP活性位點(diǎn)結(jié)合以及結(jié)合的具體位置進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

2.4 不同真菌菌絲間相互作用對(duì)MnP活性的影響

不同真菌菌絲間誘導(dǎo)主要是通過(guò)共培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)將T.versicolorshi,P.ostreatus,D.squalens,B.adusta四株菌兩兩組合,分別進(jìn)行共培養(yǎng)。

結(jié)果顯示T.versicolorshi、P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩共培養(yǎng)時(shí)MnP活性較單一菌株培養(yǎng)時(shí)均有不同程度地提高(圖4),表明這三種菌可能具有種間誘導(dǎo)能力。其中,T.versicolorshi和D.squalens共培養(yǎng)時(shí)MnP活性最高,達(dá)44.02U/L,較T.versicolorshi和D.squalens單一培養(yǎng)時(shí)的酶活0.77U/L和0.51U/L分別提高了56.17倍和85.31倍。而B(niǎo).adusta分別與上述三種真菌兩兩共培養(yǎng)時(shí)MnP活性均沒(méi)有提高(圖中未顯示),這或許因?yàn)锽.adusta不具有種間誘導(dǎo)能力。

圖4 不同真菌菌絲種間誘導(dǎo)對(duì)MnP酶活的影響Fig.4 Effect of different hyphal interspecific induction on MnP activity注：A:Trametes versicolor；B:Pleurotus ostreatus；C:Dichomitus squalens,D:Bjerkandera adusta。

早前一些研究者也嘗試通過(guò)真菌共培養(yǎng)方法來(lái)增加真菌分泌的MnP產(chǎn)量。例如,Chi Y等人[19]發(fā)現(xiàn)Pleurotus.ostreatus與Ceriporiopsis.subvermispora以及Pleurotus.ostreatus與Physisporinus.rivulosus進(jìn)行共培養(yǎng)時(shí),其MnP活性比各自單一培養(yǎng)時(shí)高,并推測(cè)是由于不同真菌對(duì)于空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素的降解增強(qiáng),同時(shí)也提高了木質(zhì)素降解酶(包括MnP)的產(chǎn)量。目前關(guān)于真菌間相互作用研究較少,因此其MnP種間誘導(dǎo)的分子機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

不同外源誘導(dǎo)物對(duì)不同白腐菌產(chǎn)MnP的誘導(dǎo)效果不同。對(duì)比T.versicolor、P.ostreatus、D.squalens和B.adusta四種菌MnP誘導(dǎo)后的活性,結(jié)果表明,T.versicolor、D.squalens、B.adusta三種菌的MnP更具外源誘導(dǎo)物誘導(dǎo)潛力,并且微量金屬離子Mn2+和Cu2+對(duì)MnP的誘導(dǎo)作用大于芳香族化合物和醇類物質(zhì),能顯著增加MnP產(chǎn)量。不同真菌相互作用時(shí),T.versicolor,P.ostreatus和D.squalens三種菌兩兩組合共培養(yǎng)的MnP活性較單一培養(yǎng)時(shí)均有明顯增加,因此推測(cè)這三種白腐菌可能具有種間誘導(dǎo)潛力。

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Induction on the Manganese Peroxidase of white-rot fungi by exogenous inducers and interspecific induction

ZHONG Zi-xuan,LIU Li,ZHANG Yong,LUO Feng*

(College of Resource and Environment,Southwest University,Chongqing Key Laboratory of bio-energy resource developement,Chongqing 400716,China)

The study investigated the MnP activity ofTrametesversicolor,Pleurotusostreatus,Dichomitussqualens,Bjerkanderaadustaby two kinds of induction,exogenous inducer and interspecific induction between different fungi,and discovered that in some induction condition,these white-rot fungi could produce large amounts of MnP. The results showed that in exogenous inducers,2,5-dimethylaniline was an effective MnP inducer,which could enhance MnP activity of four fungi to different extent. Isopropyl alcohol could enhance MnP activity ofT.versicolor,P.ostreatusandD.squalens,and it was better than that of ethanol. Cu2+could significantly enhance MnP activity ofT.versicolorandD.squalens. Mn2+could significantly enhance MnP activity ofP.ostreatusandB.adusta. When induced by interspecific induction between different fungi by co-cultivation,T.versicolor,P.ostreatusandD.squalensscould strongly enhance MnP activity each other. The study provided possibility for large production of MnP and being applied to industry.

white-rot fungi;Manganese Peroxidase;exogenous inducer;interspecific induction

2014-07-14

鐘紫旋(1991-)，女，研究生，研究方向：生物能源與環(huán)境修復(fù)。

*通訊作者:羅鋒(1977-)，男，博士，教授，研究方向：生物能源與環(huán)境修復(fù)。

國(guó)家外專干人計(jì)劃活動(dòng)專項(xiàng)(2012SWU112097)；中央高校基本科研重點(diǎn)項(xiàng)目(XDJK2011B009)資助項(xiàng)目。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.028