張 珺,何義雁,朱香燕,吳衛(wèi)國

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128)

?

張 珺,何義雁,朱香燕,吳衛(wèi)國*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128)

利用響應(yīng)面分析法對植物乳桿菌接種的發(fā)酵糙米米粉發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。以γ-氨基丁酸含量為響應(yīng)指標(biāo),以發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度為單因素考察指標(biāo),在Box-Behnken實驗設(shè)計原理的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法研究了各因素的顯著性及交互作用。確定的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵時間52h、接種量2%、發(fā)酵溫度40℃。此條件下的發(fā)酵樣γ-氨基丁酸的含量為3.14mg/g,與預(yù)測值的相對誤差為0.8%,加工成型后的糙米粉γ-氨基丁酸含量為2.92mg/g。

響應(yīng)面分析,γ-氨基丁酸,植物乳桿菌,糙米米粉,發(fā)酵

近年來,糙米作為一種富含多種活性功能成分的粗糧活躍于食品加工領(lǐng)域,主要的糙米制品有糙米餅、糙米飲料、糙米茶等。糙米中活性物質(zhì)含量豐富,主要有γ-氨基丁酸、谷維素、抗性淀粉、烷基間苯二酚、維生素B等[1]。為達(dá)到資源的充分利用,活性物質(zhì)的充分保留,有研究將糙米先進(jìn)行發(fā)芽處理再加工,這樣既能極大保留甚至提高糙米中的活性物質(zhì),又能解決糙米口感粗糙的問題[2]。除此之外,通過接種植物乳桿菌對糙米采用乳酸發(fā)酵處理,不僅能大大改善糙米的加工性能[3],還能提高其中活性成分尤其是γ-氨基丁酸的含量[4],以此加工的糙米米粉還具有令人愉快的發(fā)酵風(fēng)味。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于高等植物和藻類植物中的四碳非蛋白類氨基酸,是一種主要的中樞系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑[5],具有降血壓[6]、利尿[7]、安定神經(jīng)[8]、抗癌[9]等生理功能。接種植物乳桿菌的糙米進(jìn)行乳酸發(fā)酵的過程中產(chǎn)生了谷氨酸脫羧酶,這種酶能夠使谷氨酸發(fā)生不可逆脫羧反應(yīng),生成大量的γ-氨基丁酸[10]。

本實驗?zāi)康脑谟诓捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵糙米米粉工藝,以發(fā)酵過程中γ-氨基丁酸的含量為響應(yīng)指標(biāo),得到一種富含γ-氨基丁酸的發(fā)酵糙米米粉。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙米 湖南省長沙縣;GABA標(biāo)準(zhǔn)品 Adamas公司;植物乳桿菌 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院重點實驗室;MRS肉湯培養(yǎng)基,無菌水,60%乙醇;7.5%次氯酸鈉(v/v,有效氯≥10%);6%重蒸苯酚(v/v);0.1mol/L四硼酸鈉緩沖溶液。

YXQ-LS-50SII高壓滅菌鍋 上海曉科科學(xué)儀器有限公司;JB-FY-1300IIU無菌操作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPX系列生化培養(yǎng)箱 常州歐邦電子有限公司;7200可見光分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;101A-3ET電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實驗儀器有限公司;打漿機(jī) 九陽股份有限公司;蒸鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司;培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃器皿若干。

1.2 實驗方法

1.2.1 GABA測定方法 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]:以60%乙醇為溶劑,準(zhǔn)確配制0.01、0.04、0.1、0.25、0.5mg/mL GABA標(biāo)準(zhǔn)品。分別取3mL以上濃度的標(biāo)準(zhǔn)試液,每組添加6mL次氯酸鈉,2mL苯酚溶液,并用四硼酸鈉調(diào)pH9.0,避光放置30min后于635nm處測定吸光度。得到GABA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.554x+0.1283,R2=0.974,y為吸光度,x為GABA標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

樣品中GABA測定方法:取10g發(fā)酵糙米米漿,以1∶3的料液比加入60%的乙醇作為提取劑,60℃下持續(xù)振蕩2h,取出冷卻、過濾得到GABA提取液。取3mL提取液按以上標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定吸光度;同時,取出同一發(fā)酵批次的米漿進(jìn)行水分的測定。最后根據(jù)吸光度值及水分含量值計算出發(fā)酵樣中GABA含量,所得GABA含量數(shù)值均以干基計。

1.2.2 植物乳桿菌的活化及菌懸液的配制 將實驗室保存的植物乳桿菌菌種接種至滅菌處理過的MRS肉湯培養(yǎng)基中,于37℃恒溫培養(yǎng)12h后,培養(yǎng)基下方出現(xiàn)明顯的菌層。搖勻成菌懸液,在無菌操作臺上進(jìn)行菌種的稀釋計數(shù),稀釋倍數(shù)為10-8,根據(jù)平板計數(shù)法,得到稀釋后菌懸液的活菌數(shù)為4.9×109cfu/mL。將此菌懸液于0℃下貯存,用于接種糙米[12]。

1.2.3 發(fā)酵糙米米粉的制作工藝 將糙米用無菌水沖洗兩次,去掉谷殼屑等雜質(zhì),取40g糙米于滅菌后的三角瓶,加40mL無菌水后進(jìn)行接種密封。將處理后的試樣于一定溫度下培養(yǎng)一段時間后進(jìn)行米粉的制作。

米粉制作簡要工藝[13]:取樣→打漿→攤漿→蒸煮→回生成型→烘干。其中,磨漿糙米及漿液直接取自發(fā)酵樣;蒸煮成型時間控制在40～60s內(nèi),將成型后的糙米米粉于室溫條件下老化后進(jìn)行切片晾干。

1.2.4 單因素實驗 考察植物乳桿菌接種糙米進(jìn)行發(fā)酵的單因素指標(biāo)為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量。固定發(fā)酵時間24h,接種量2%,發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40、45℃;固定發(fā)酵溫度40℃,接種量2%,發(fā)酵時間分別為0、12、24、36、48、60h;固定發(fā)酵溫度40℃,發(fā)酵時間24h,接種量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%。以GABA的含量為單因素考察指標(biāo)。

1.2.5 響應(yīng)面分析實驗 綜合單因素實驗結(jié)果,確定了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量三個因素的三個水平,根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理,采用響應(yīng)面分析方法,因素水平設(shè)計表見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素及水平Table1 Code values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010和Design-Expert 8.0.5.0軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析與方差分析。

1.2.7 發(fā)酵米粉的綜合評價 通過對比發(fā)酵米粉與未發(fā)酵米粉的GABA含量,蒸煮性質(zhì)及口感來進(jìn)行發(fā)酵米粉的綜合評價。未發(fā)酵糙米米粉的制作方法,將糙米浸泡12h后按1.2.3的工藝進(jìn)行。

蒸煮性質(zhì)通過比較兩種米粉蒸煮難易程度、斷條情況來評價,口感通過比較兩種米粉入口細(xì)膩程度及口味來評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果及分析

2.1.1 發(fā)酵時間對GABA含量的影響 從圖1可以看出,發(fā)酵糙米中的GABA含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加,0～24h內(nèi)GABA含量增加明顯，發(fā)酵時間超過48h后，GABA的含量變化則逐漸趨于平緩。可能原因是，0～24h是植物乳桿菌的生長及生理活躍時期，此條件下糙米中的蛋白質(zhì)被大量分解利用，使發(fā)酵樣中GABA含量呈快速增長趨勢，而發(fā)酵48h后,谷氨酸脫羧酶與底物的反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到了飽和程度,繼續(xù)反應(yīng)GABA的含量也不會增加,還可能會被其他微生物利用。

圖1 發(fā)酵時間對GABA含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the content of GABA

2.1.2 接種量對GABA含量的影響 從圖2可以看出,發(fā)酵時間一定的情況下GABA的含量隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在接種量為2%的條件下,含量達(dá)到最大。說明了接種量為2%時,發(fā)酵樣既可以維持乳桿菌的正常生理功能又能為生成GABA的酶促反應(yīng)提供足夠的底物;當(dāng)接種量超過2%時,發(fā)酵樣中的能源物質(zhì)在滿足乳桿菌的生長后,已不足以滿足酶促反應(yīng),導(dǎo)致了GABA的含量有所降低。

圖2 接種量對GABA含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the content of GABA

2.1.3 發(fā)酵溫度對GABA含量的影響 從圖3可以看出,GABA的含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈先增加后降低的趨勢,在40℃時含量達(dá)到最大值。說明了植物乳桿菌的最適溫度在40℃附近,在最適溫度的生長條件下乳桿菌的各項生理功能指標(biāo)達(dá)到最佳,所產(chǎn)生的酶也達(dá)到最多,故生成的GABA含量最多。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for the proposed regression model

圖3 發(fā)酵溫度對GABA含量的影響Fig.3 Effect of culture temperature on the content of GABA

注:*差異顯著(p<0.05);**差異極顯著(p<0.01)。

2.2 響應(yīng)面實驗

響應(yīng)面組實驗結(jié)果見表2。通過Design-Expert 8.0.5.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合后,得到的GABA的含量對發(fā)酵時間A、接種量B、發(fā)酵溫度C的二次多項式回歸方程為Y=3.12+0.15A-0.067B+0.039C+1.0×10-2AB-7.5×10-3AC+0.015BC-0.19A2-0.13B2-0.063C2。

表2 Box-Benhnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Box-Benhnken experimental design arrangement and correspongding results

表3顯示了回歸模型方差分析的結(jié)果。模型呈極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著,R2=0.9988,說明了該模型與實際實驗擬合度好,在一定實驗范圍內(nèi)能用于指標(biāo)的預(yù)測以及進(jìn)行參數(shù)對指標(biāo)影響規(guī)律的分析。從模型中可以看出,發(fā)酵時間(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)對GABA含量的影響均為極顯著,影響順序為A>B>C;交互項中,BC交互作用顯著,AB、AC交互作用不顯著,說明了接種量和培養(yǎng)溫度對發(fā)酵樣中GABA含量的影響顯著,即足夠的植物乳桿菌在適宜的生長溫度下能明顯地提高GABA的含量。

2.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析

圖4為Design Expert 8.0.5.0做出的兩因素自變量對指標(biāo)的3D響應(yīng)曲面,由圖可以直觀地反映每個因素對響應(yīng)值的影響及兩兩交互作用。發(fā)酵溫度固定為最佳值40℃時(圖4a),GABA的含量隨著接種量的增大呈先增后減的趨勢、隨發(fā)酵時間的延長也成先增后減的趨勢,接種量的最佳水平范圍為1.55%～2.20%,發(fā)酵時間的最佳水平范圍為46～59h;接種量固定為最佳值2%時(圖4b),兩個因素對GABA含量的影響同為先增后減趨勢,在實驗范圍內(nèi)發(fā)酵溫度的最佳水平范圍為37.5～45℃,接種量的最佳水平范圍為1.6%～2.16%;發(fā)酵時間固定為最佳水平48h時(圖4c),兩個因素對GABA含量的影響同為先增后減趨勢,發(fā)酵時間的最佳水平范圍為46～59h,發(fā)酵溫度在實驗范圍內(nèi)的最佳水平范圍為36.5～46.1℃。

圖4 兩因素對GABA含量影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the content of GABA注:a：固定發(fā)酵溫度40℃;b：固定接種量2%;c：固定發(fā)酵時間48h。

通過響應(yīng)面的優(yōu)化分析,各因素的最佳水平為發(fā)酵時間52.57h,接種量1.89%,發(fā)酵溫度41.28℃,GABA含量的預(yù)測值為3.165mg/g。為操作方便,將最佳條件設(shè)置為發(fā)酵時間52h,接種量2%,發(fā)酵溫度40℃,此條件下進(jìn)行平行驗證實驗,GABA平均含量為3.14mg/g,與預(yù)測值的相對誤差約為0.8%。

2.4 發(fā)酵米粉的綜合評價

將最優(yōu)條件下的發(fā)酵樣加工成米粉,于40℃下烘干,測定干樣中的GABA含量為2.92mg/g,米粉加工過程GABA的損失率為7%;按同樣的方法測定未接種植物乳桿菌的非發(fā)酵糙米米粉中的GABA,含量為0.87mg/g。則發(fā)酵過的糙米米粉中GABA含量是未發(fā)酵過的3.36倍。

米粉的蒸煮性上,最優(yōu)條件下的發(fā)酵米粉比未發(fā)酵的米粉更易熟且不易斷條;口感上,發(fā)酵米粉口感要更細(xì)膩且有一定的發(fā)酵風(fēng)味,口味無明顯酸味。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法對發(fā)酵糙米米粉發(fā)酵工藝的優(yōu)化,以糙米中的GABA含量為響應(yīng)指標(biāo),糙米米粉的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間52h、接種量2%、發(fā)酵溫度40℃;此條件下的GABA實際測定值為3.14mg/g,與理論含量3.165mg/g的相對誤差為0.8%。綜合方差分析的評價,可見響應(yīng)面優(yōu)化糙米米粉的發(fā)酵工藝參數(shù)可靠。

通過比較兩種米粉的GABA含量、蒸煮性質(zhì)及口感,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵米粉較未發(fā)酵米粉有很大的改善。因此,無論在營養(yǎng)成分還是在口感上,發(fā)酵米粉都有廣闊的發(fā)展空間。

[1]張珺,吳衛(wèi)國,何義雁,等.糙米中植物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].糧食與飼料工業(yè)，2014(5):1-4.

[2]鄭藝梅.發(fā)芽糙米營養(yǎng)特性,γ-氨基丁酸富集及生理功效的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[3]閔偉紅.乳酸菌發(fā)酵改善米粉食用品質(zhì)機(jī)理的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003(6)：5-9.

[4]Lea B,Kim J,Kang Y M,et al. Antioxidant activity and r-aminobutyric acid(GABA)content in sea tangle fermented by Lactobacillus brevis BJ20 isolated from traditional fermented foods[J]. Food Chemistry,2010,122:271-276.

[5]Kim J Y,Lee M Y,Ji G E,et al. Production of γ-aminobutyric acid in black raspberry juice during fermentation by Lactobacillus brevis GABA100[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,130(1):12-16.

[6]Aoki H,Furuya Y,Endo Y,et al. Effect of γ-aminobutyric acid-enriched tempeh-like fermented soybean(GABA-tempeh)on the blood pressure of spontaneously hypertensive rats[J]. Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2003,67(8):1806-1808.

[7]Jakobs C,Jaeken J,Gibson K M. Inherited disorders of GABA metabolism[J]. Journal of Inherited Metabolic Disease,1993,16(4):704-715.

[8]Wong T,Guin C,Bottiglieri T,et al. GABA,γ-hydroxybutyric acid,and neurological disease[J]. Annals of Neurology,2003,54(S6):S3-S12.

[9]Seeram N P,Adams L S,Zhang Y,et al. Blackberry,black raspberry,blueberry,cranberry,red raspberry,and strawberryextracts inhibit growth and stimulate apoptosis of human cancer cellsinvitro[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(25):9329-9339.

[10]Shelp B J,Bown A W,McLean M D. Metabolism and functions of gamma-aminobutyric acid[J]. Trends in Plant Science,1999,4(11):446-452.

[11]陳恩成,張名位,彭超英,等.比色法快速測定糙米中γ-氨基丁酸含量研究[J].中國糧油學(xué)報,2006,21(1):125-128.

[12]周顯青,陶華堂,王學(xué)鋒,等.植物乳桿菌大米發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,34(6):1-7.

[13]楊大慶,魏尚洲.糙米米粉的加工[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2004(5):29-30.

Process of fermentation brown rice noodle rich in γ-aminobutyric

ZHANG Jun,HE Yi-yan,ZHU Xiang-yan,WU Wei-guo*

(Food Science and Technology College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

The objective of this study was to optimize the process of brown rice noodle fermented by Lactobacillus. Single-factor and orthogonal experiments was based on three process parameters including fermentation time,inoculation amount and culture temperature. The content of γ-aminobutyric acid was response value. The three process conditions were optimized by response surface analysis based on a three-variable,three-level Box-Behnken experimental design. The optimized fermentation parameters were as follows:fermentation time 52h,inoculation amount 2%,culture temperature 40℃. Under this condition the content of γ-aminobutyric acid was 3.14mg/g,which showed a relative error of 0.8% when compared with the predictive value. After threatment of forming the content of γ-aminobutyric acid was 2.92mg/g.

response surface methodology;γ-aminobutyric acid;lactobacillus;brown rice noodle;fermentation

2014-09-16

張珺(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：食品科學(xué)。

*通訊作者:吳衛(wèi)國(1968-)，男，博士，教授，研究方向：糧食加工工程。

2014年國家糧食公益性科研專項。

TS213.3

B

:1002-0306(2015)09-0239-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.043