李小凡,王常青,訾 艷,陳 彤,郝志萍,于文娟

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

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香菇柄中水溶性蛋白的提取及組成分析

李小凡,王常青*,訾 艷,陳 彤,郝志萍,于文娟

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006)

本文研究了在微堿性環(huán)境下提取香菇柄水溶性蛋白的最佳工藝,并測(cè)定了該蛋白的等電點(diǎn)與分子量。結(jié)果表明:香菇柄水溶性蛋白的最佳提取條件為料液比1∶28,提取時(shí)間6h,提取溫度24℃；此條件下,水溶性蛋白的提取率可以達(dá)到香菇柄中總蛋白的52.8%；SDS-PAGE電泳分析表明:在該條件下,得到的水溶性蛋白質(zhì)分子量較大,且大都集中于40～50ku左右；香菇柄中水溶性蛋白的等電點(diǎn)結(jié)果為pH4.3,與大多植物蛋白的等電點(diǎn)接近。

香菇柄,提取工藝,分子量,等電點(diǎn)

香菇(Lentinus edodes)是一種藥食兩用的真菌,我國(guó)香菇年產(chǎn)量已達(dá)300多萬(wàn)噸,居世界之首[1]。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于香菇的研究主要集中于香菇多糖[2],香菇柄因?yàn)樗苄远嗵呛可?纖維化程度高、適口性差,以及受加工技術(shù)所限,往往被當(dāng)作廢棄料[3]。香菇柄約占香菇總重的30%,其中蛋白質(zhì)約為19%,可溶性多糖4%,纖維素65%,脂肪2.6%,有一定的食用價(jià)值。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全國(guó)每年約有5萬(wàn)噸(10%～15%)的香菇柄當(dāng)做肥料或直接廢棄,造成了的資源浪費(fèi)[4]。本文針對(duì)這一現(xiàn)狀,對(duì)香菇柄中水溶性蛋白的提取工藝及其性質(zhì)進(jìn)行了探討,以期為香菇柄蛋白的加工利用奠定基礎(chǔ),對(duì)促進(jìn)香菇資源的深度開(kāi)發(fā),延伸產(chǎn)業(yè)鏈,減少環(huán)境污染具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干香菇和香菇柄 購(gòu)于河南西峽縣；蛋白質(zhì)電泳Marker 北京天恩澤基因科技有限公司;硫酸銅,氫氧化鈉,苯酚和丙酮等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2600型分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；凱式定氮儀 上海申生科技有限公司;R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；DYCZ-23A型電泳儀 北京市六一儀器廠；其它儀器均為常規(guī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干香菇蓋和香菇柄中主要成分的測(cè)定方法 為了分析香菇柄和香菇蓋中主要營(yíng)養(yǎng)成分的差異,本文按照國(guó)標(biāo)法對(duì)蛋白、多糖等成分進(jìn)行了分析測(cè)定。其中水分按照GB 5009.3-2010中“直接干燥法”測(cè)定；灰分按照GB 5009.4-2010測(cè)定；蛋白質(zhì)按照GB 5009.5-2010中“凱氏定氮法”測(cè)定；多糖按照NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定；脂肪按照GB/T 14772-2008測(cè)定；膳食纖維按照GB/T 22224-2008測(cè)定。

1.2.2 香菇柄水溶性蛋白的提取 香菇柄粉碎后,加入蒸餾水,調(diào)節(jié)pH到8.5,然后在不同的提取料液比、時(shí)間、溫度進(jìn)行提取后,離心(3000r/min,10min)收集上清液,經(jīng)濾紙粗濾后,濾液在55℃,0.09MPa下進(jìn)行真空濃縮,計(jì)算蛋白提取率。

其中:c:提取液蛋白質(zhì)濃度g/mL;v:提取液體積mL;m:提取時(shí)所取香菇柄粉質(zhì)量g;w:香菇柄粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 香菇柄水溶性蛋白提取工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 取10g粉碎的香菇柄,加入pH8.5的提取液,放入恒溫水浴鍋中,在不同條件進(jìn)行提取。分別考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)香菇柄水溶性蛋白提取率的影響[5-6]。提取料液比單因素實(shí)驗(yàn)分別1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)分別為4、5、6、7、8h；提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)分別為10、15、20、25、30℃。

1.2.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)中提取溫度,提取時(shí)間和料液比三個(gè)因素的水平選擇原則為,以相應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)得到的各因素最佳條件或其左右為第二水平,在此水平前后縮小實(shí)驗(yàn)間距,各取一個(gè)點(diǎn)作為第一和第三水平；考察三因素對(duì)水溶性蛋白提取率的影響,L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels Tableof orthogonal experiment

1.2.4 香菇柄清蛋白分子量的分析 用SDS-PAGE凝膠電泳法分析香菇柄水溶性蛋白亞基的相對(duì)分子質(zhì)量。分離膠濃度12%,濃縮膠濃度5%,考馬斯亮藍(lán) R-250 染色,上樣量12μL。利用一元線性回歸分析方法,將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)遷移率對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算香菇柄水溶性蛋白亞基的相對(duì)分子質(zhì)量[7]。

1.2.5 香菇柄清蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定 取0.5%的香菇柄水溶性蛋白提取液9份,分別調(diào)節(jié)pH2～9,間隔為1。靜置30min后離心,測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量[8]。再在蛋白質(zhì)含量最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH兩側(cè)間隔0.2分別取4個(gè)點(diǎn),測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量,最小值對(duì)應(yīng)的pH即為水溶性蛋白的等電點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇柄和香菇蓋主要成分的測(cè)定結(jié)果

由表2可知,香菇柄與香菇蓋相比,菇柄多糖含量明顯低于菇蓋,蛋白較蓋中少10.2%,但是由于柄中纖維較多,所以提取蛋白時(shí)易于分離純化,水溶性蛋白提取后,可以對(duì)殘?jiān)械纳攀忱w維進(jìn)行進(jìn)一步的研究利用[9]。由均值T檢驗(yàn)可知,香菇柄與香菇蓋主要成分中,除含水量和脂肪無(wú)顯著性差異外,二者的灰分、蛋白質(zhì)、多糖和膳食纖維含量均有顯著差異。因香菇蓋中多糖含量高被廣泛用于多糖的提取,而香菇柄中因膳食纖維含量較大,質(zhì)地粗糙,往往被丟棄。但香菇柄中的蛋白含量將近占總重的1/5,所以應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的提取和利用。

表2 香菇柄及香菇蓋主要成分比較(%)Table2 The main compositions of lentinus edodes caps and steams(%)

注:*p<0.05,**p<0.01。

2.2 香菇柄清蛋白提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在20℃提取3h時(shí)發(fā)現(xiàn),料液比低于1∶25時(shí),香菇柄水溶性蛋白的提取率隨料液比的增大而增高,當(dāng)料液比為1∶25時(shí),水溶性蛋白的提取率達(dá)到最大,之后,隨著料液比的增加,蛋白的提取率基本不在變化,其原因可能是加水量過(guò)少,體系黏度大,蛋白不易溶出,但隨著料液比的增大,蛋白溶出率卻會(huì)趨于平衡[10]。因此,香菇柄水溶性蛋白的最佳提取料液比為1∶25。提取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)表明,在料液比1∶25,提取溫度20℃時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,香菇柄水溶性蛋白的提取率呈先增加,到提取時(shí)間為6h時(shí),水溶性蛋白的提取率最大,達(dá)到39.4%,之后有下降的趨勢(shì)?？赡苁请S著提取時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白的溶出逐漸充分。但是進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致香菇柄中其他物質(zhì)的溶出,導(dǎo)致提取率的下降[11]。因此,香菇柄中水溶性蛋白的最佳提取時(shí)間為6h。提取溫度實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)料液比為1∶25,提取時(shí)間3h的情況下,隨著溫度的升高,香菇柄水溶性蛋白的提取率明顯增高,25℃處有最大值；高于25℃,提取率稍有下降。原因可能是隨著溫度的提高,香菇柄中果膠的溶出增加,附著在香菇柄表面,可能阻礙水溶性蛋白的溶出。因此,香菇柄水溶性蛋白的最佳提取溫度為25℃。

圖1 料液比(A)、提取時(shí)間(B)及提取溫度(C)對(duì)水溶性蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio(A)、extraction time(B)and extraction temperature(C)on extraction ratio of water-soluble protein

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由正交實(shí)驗(yàn)表3可知,影響香菇柄水溶性蛋白提取率的因素為:C>A>B,即提取溫度對(duì)香菇柄水溶性蛋白提取率的影響最大,料液比次之,提取時(shí)間最小。最佳工藝組合為A3B2C2,即料液比為1∶28,提取時(shí)間為6h,提取溫度為24℃。在最優(yōu)水平A3B2C2下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),香菇柄水溶性蛋白提取率的平均值為52.8%,高于正交表中其他水平的提取率。

正交實(shí)驗(yàn)的方差分析可知(見(jiàn)表4),提取溫度對(duì)水溶性蛋白提取率的影響顯著(p<0.05),而料液比和提取時(shí)間的影響不顯著。

表3 香菇柄水溶性蛋白提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 The result of the orthogonal experiment of extraction technology of lentinus edodes steams water-soluble protein

2.4 香菇柄水溶性蛋白分子量分布分析

取最佳條件下提取的香菇柄水溶性蛋白,透析脫鹽后進(jìn)行電泳分析(圖2),將水溶性蛋白電泳條帶的相對(duì)遷移率帶入蛋白質(zhì)Marker標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-1.638x+5.144,R2=0.986)中,計(jì)算該蛋白主要亞基的分子量。結(jié)果表明:在24℃微堿性下所得的香菇柄蛋白共分離出4條蛋白亞基條帶,其分子量依次為57.68、52.31、41.96和23.88ku。本實(shí)驗(yàn)研究條件下,提取的香菇柄水溶性蛋白分子量較大,且相對(duì)集中,容易實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的分離和純化工作。

表4 香菇柄水溶性蛋白提取工藝正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table4 Analysis of variance Tableof extraction technology of lentinus edodes steams water-soluble protein

注:*p<0.05。

圖2 香菇柄水溶性蛋白SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE figure of water-soluble protein from lentinus edodes stems注：A香菇柄水溶性蛋白；B：蛋白質(zhì)Marker。

2.5 香菇柄水溶性蛋白等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

如圖3所示,在pH為4.3時(shí),上清液中的蛋白含量最低,所以香菇柄水溶性蛋白的等電點(diǎn)為pH4.3,與大多數(shù)植物蛋白等電點(diǎn)相接近。

圖3 香菇柄水溶性蛋白等電點(diǎn)Fig.3 Isoelectric point of lentinus edodes steams water-solube protein

3 結(jié)論與討論

電泳分析表明,香菇柄水溶性蛋白分子量多集中于40～50ku左右,易于進(jìn)一步分離純化,易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化分離與加工,對(duì)香菇柄的開(kāi)發(fā)利用具有一定意義。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),香菇柄水溶性蛋白最佳提取條件為:料液比1∶24,提取時(shí)間6h,提取溫度24℃,此條件下的蛋白提取率為52.8%;香菇柄水溶性蛋白的等電點(diǎn)為pH4.3。不過(guò),由于本試驗(yàn)未考慮交互作用對(duì)提取率的影響,所以,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能還存在不準(zhǔn)確性,有待于以后進(jìn)一步完善。

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Study on the extraction technology and molecular composition of water-soluble protein from lentinus edodes stems

LI Xiao-fan,WANG Chang-qing*,ZI Yan,CHEN Tong,HAO Zhi-ping,YU Wen-juan

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

An optimal extraction condition of water-soluble protein from lentinus edodes stems in alkalescency was studied and the isoelectric point and molecular weight of this protein were measured as well. The results showed that the best extraction conditions of water-soluble protein from lentinus edodes stems,solvent ratio,extraction time and extraction temperature,were 1∶28,6h and 24℃ respectively,and the ratio of this protein extraction was 52.8% under the above conditions. SDS-PAGE electrophoretic analysis result indicated that the molecular weight of protein subunit bands are larger and concentrated in about 40～50ku. The isoelectric point of the water-soluble protein in lentinus edodes stems was pH4.3,close to that of most plant proteins.

lentinus edodes stems；extraction technique；molecular weight；isoelectric point

2014-07-23

李小凡(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)與功能食品開(kāi)發(fā)。

*通訊作者:王常青(1956-)，男，學(xué)士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與功能食品開(kāi)發(fā)。

TS201.4

A

:1002-0306(2015)09-0343-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.066