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      刺參性腺中6種磷脂含量的HPLC-ELSD分析

      2015-02-17 08:42:08朱瑤陳慧民盧航高銘陽(yáng)溫馨胡建恩
      關(guān)鍵詞:總脂刺參性腺

      朱瑤,陳慧民,盧航,高銘陽(yáng),溫馨,胡建恩

      (大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

      中國(guó)共有140多種海參,其中大約有20種可食用[1]。海參含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、微量元素、黏多糖、脂肪酸,是滋補(bǔ)珍品。國(guó)內(nèi)外有大量關(guān)于海參體壁營(yíng)養(yǎng)成分的研究報(bào)道,但關(guān)于海參加工副產(chǎn)物的研究較少。海參性腺又稱為海參花,是高級(jí)美味的食材。與海參體壁相比,海參性腺中還含有豐富的性腺色素、磷脂等,但對(duì)海參性腺磷脂的研究目前卻尚未見(jiàn)報(bào)道。

      海洋磷脂是重要的功能性組分,以磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺為主。海洋磷脂中含有大量二十二碳六烯酸 (DHA)和二十碳五烯酸 (EPA)等ω-3不飽和脂肪酸[2],具有較高的生物活性。磷脂分析常用的方法有薄層色譜 (TLC)、高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜 (MS)、氣質(zhì)聯(lián)用 (C-MS)技術(shù)等,隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,更為強(qiáng)大的LC-MS方法也用于磷脂的定向定量分析中。LC-MS方法不僅能將磷脂組間分離定量,還有助于檢測(cè)未分離的同類磷脂化合物[3-4]。HPLC是目前磷脂分離和定性定量分析中最常用的方法,紫外檢測(cè)器 (UV)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 (ELSD)是常用檢測(cè)器。其中,ELSD的響應(yīng)信號(hào)獨(dú)立于分子中的雙鍵數(shù)目,也比UV檢測(cè)器更為靈敏,并且ELSD在梯度洗脫程序中能提供穩(wěn)定的基線[5],因此,ELSD越來(lái)越多地用于磷脂的高效液相色譜分析。

      正相色譜分離不同種類的磷脂主要基于頭部基團(tuán)極性大小;而反相色譜分離磷脂主要基于磷脂上脂肪酸?;湹氖杷圆煌?。但相比而言,后者一般分離度較差,峰重合嚴(yán)重[3]。正相色譜分析磷脂的流動(dòng)相一般分為兩類:正己烷-異丙醇-水體系和氯仿-甲醇-水 (氨水)體系。前者多使用等度洗脫,分離過(guò)程中往往存在分離時(shí)間長(zhǎng)、峰形擴(kuò)散嚴(yán)重、定量不穩(wěn)定等問(wèn)題[6];而后者因氯仿本底吸收很高,故搭配ELSD檢測(cè)器進(jìn)行梯度洗脫,對(duì)磷脂的分離效果較好。Narváez-Rivas等[7]使用氯仿-甲醇-水體系,加入三乙胺和氨水調(diào)節(jié)pH,對(duì)伊比利亞豬皮下脂肪中的心磷脂 (CL)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇 (PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿 (PC)、鞘磷脂 (SM)和溶血磷脂酰膽堿 (LPC)等7種磷脂進(jìn)行了分析,均分離良好,定量穩(wěn)定。但是高效液相色譜儀中存在聚合物材質(zhì)的配件在氯仿中可能發(fā)生溶脹或收縮,影響機(jī)器的氣密性和使用壽命。本研究中,使用聚醚醚酮(PEEK)作為正相整體硅膠柱的包覆材料,為了保護(hù)高效液相色譜儀及硅膠柱,選擇正己烷-異丙醇-水體系作為流動(dòng)相梯度洗脫,對(duì)刺參性腺中的磷脂組成進(jìn)行分析,旨在為刺參性腺中磷脂的測(cè)定提供一種簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確的分析方法,也為刺參性腺的加工利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      刺參性腺由大連濱海海洋生物有限公司提供,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

      PC、PE、PI、PS、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;正己烷、異丙醇均為色譜級(jí),購(gòu)自瑞典Oceanpak公司;氯仿、甲醇、冰乙酸等其他試劑均為分析純。高效液相色譜儀為日立LaChrom Elite系列,色譜柱為默克公司Chromolith?Performance-Si型正相硅膠色譜柱 (100 mm×4.6 mm),蒸發(fā)光檢測(cè)器為Alltech 2000。

      1.2 方法

      1.2.1 總脂的提取 刺參性腺總脂的提取根據(jù)Folch等[8]的方法稍作改進(jìn)。將刺參性腺用流水解凍,使用高速組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿。取小部分勻漿液進(jìn)行水分含量的測(cè)定,其余勻漿液以1∶10(g∶mL)的比例與氯仿-甲醇 (體積比為2∶1)溶液混合,攪拌,靜置10 min后抽濾,收集濾液,對(duì)濾渣重復(fù)兩次上述操作。將上述所得濾液合并至分液漏斗中,加入1/5體積的0.9%NaCl溶液,振蕩搖勻后靜置過(guò)夜,收集下層氯仿層,通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后,于45℃下真空旋蒸至干,旋蒸瓶中殘余物即為刺參性腺總脂。

      1.2.2 磷脂的純化 取100 g硅膠濕法裝柱,待柱子平衡過(guò)夜后,稱取刺參性腺總脂約600 mg用少量氯仿溶解后上樣,依次用5倍柱體積的氯仿洗脫中性脂,3倍柱體積的丙酮洗脫糖脂和色素,再用甲醇將磷脂洗脫下來(lái)[2,9],分別收集并稱重,記錄各部分含量。將磷脂溶于氯仿中,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.3 HPLC-ELSD磷脂樣品的制備 吸取適量柱層析刺參性腺磷脂樣品 (PLs)氯仿溶液,用氮?dú)獯蹈珊缶_稱取殘余物質(zhì)量,按照一定濃度溶解于HPLC級(jí)正己烷-異丙醇 (體積比為3∶1)混合液中。使用前用0.22 μm孔徑的有機(jī)相濾膜過(guò)濾。

      1.2.4 刺參性腺磷脂的高效液相色譜分析 用高效液相色譜儀搭配Alltech 2000蒸發(fā)光檢測(cè)器,采用三元梯度洗脫,流動(dòng)相A為正己烷 (含0.04%三乙胺),流動(dòng)相B為異丙醇,流動(dòng)相C為13%乙酸溶液,洗脫流速為1.5 mL/min,柱溫25℃[10]。梯度洗脫程序如表1所示。

      表1 梯度洗脫流動(dòng)相組成Tab.1 Composition of ternary gradient mobile phase

      蒸發(fā)光檢測(cè)器采用分流模式,以空氣作為霧化氣,氣體流速為1.7 L/min,漂移管溫度為45℃。將PE、PI、PS、PC、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為0.6~1.0 mg/mL的溶液,分別單獨(dú)進(jìn)樣,記錄出峰時(shí)間,以對(duì)刺參性腺中的磷脂進(jìn)行定性。同時(shí)將磷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶液梯度稀釋進(jìn)樣,以磷脂標(biāo)品含量為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用外標(biāo)法對(duì)刺參性腺磷脂中6種磷脂進(jìn)行定量。同時(shí),對(duì)PE、PI、PS、PC、SM、LPC 6種標(biāo)準(zhǔn)樣品同一濃度重復(fù)進(jìn)樣3次,記錄峰面積,計(jì)算各類磷脂峰面積的平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與變異系數(shù)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 刺參性腺中脂質(zhì)的基本組成

      經(jīng)測(cè)定,刺參性腺中總脂含量為 (16.33±0.42)%(干質(zhì)量),其中磷脂占總脂的 (49.31±0.76)%,糖脂和色素的含量為 (42.11±0.89)%,而中性脂僅占 (8.09±0.93)%。因此,刺參性腺脂質(zhì)具有低膽固醇、高磷脂、高糖脂的特性,具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

      2.2 混合磷脂標(biāo)準(zhǔn)品及刺參性腺磷脂的高效液相色譜分析

      按洗脫程序,PE、PI、PS、PC、SM 和 LPC標(biāo)準(zhǔn)品混合物以及刺參性腺磷脂樣品均能達(dá)到基線分離 (圖1、圖2)且峰形良好,成單峰。每次分析均能在15 min內(nèi)完成,平衡9 min后進(jìn)下一樣品。ELSD的輸出信號(hào)與進(jìn)樣量的對(duì)應(yīng)關(guān)系比較復(fù)雜,故HPLC-ELSD用于定量分析不能采用面積歸一法。理論上,ELSD響應(yīng)值與樣品質(zhì)量為y=axb的指數(shù)函數(shù)關(guān)系,也有研究發(fā)現(xiàn),在一定濃度范圍內(nèi),ELSD 的響應(yīng)值與樣品質(zhì)量呈線性相關(guān)[2,7]。本試驗(yàn)中在以下標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)梯度稀釋進(jìn)樣:PE(0.25~20.00 μg),PI(0.13~10.00 μg),PS(0.50~ 16.00 μg),PC(0.44 ~ 35.00 μg),SM(0.06~6.00 μg),LPC(0.50~20.00 μg)。以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),以y=axb指數(shù)函數(shù)模型和y=a+bx線性關(guān)系模型分別進(jìn)行擬合,結(jié)果兩種模型的R2均大于0.99。

      圖1 6種磷脂混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC-ELSD圖譜Fig.1 HPLC-ELSD profile of six phospholipid standards

      圖2 刺參性腺磷脂HPLC-ELSD圖譜Fig.2 HPLC-ELSD profile of phospholipids in gonad of sea cucumber Apostichopus japonicus

      從表3可見(jiàn),y=a+bx模型較y=axb模型擬合得更好。即在本研究選擇的濃度范圍內(nèi),ELSD檢測(cè)器的輸出信號(hào)與進(jìn)樣量之間的關(guān)系是符合線性關(guān)系的,故選擇y=a+bx的線性關(guān)系模型作為磷脂定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)刺參性腺中各類磷脂進(jìn)行定量。

      表3 磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值Tab.3 Calibration curves and R2of the phospholipid standards

      表4列出了磷脂標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3次進(jìn)樣的峰面積的平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、變異系數(shù)值。由此可知,所有磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積重現(xiàn)性很好,變異系數(shù)值均小于3.5%。

      表4 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的重現(xiàn)性Tab.4 Reproducibility of detector response of phospholipid standards

      2.3 刺參性腺磷脂樣品分析

      經(jīng)計(jì)算,刺參性腺中 PE、PI、PS、PC、SM磷脂的含量分別為(1.884±0.023)、(0.274±0.003)、 (0.847 ± 0.019)、 (4.637 ± 0.106)、(0.023±0.002)g/kg(磷脂樣品),LPC 未檢出。PC、PE和PS 3種磷脂的含量較高,總含量達(dá)到7.368 g/kg(磷脂樣品),其中 PC含量最高,為4.637 g/kg(磷脂樣品),占總脂的22.86%,占性腺干質(zhì)量的3.73%。本試驗(yàn)中,除去已知的6種磷脂,刺參性腺磷脂中還存在其他兩種磷脂組分X1、X2,參考其他磷脂分析文獻(xiàn),這兩種磷脂可能是磷脂酸 (PA)和磷脂酰甘油 (PG),但也有文獻(xiàn)指出,可能存在與磷脂酰乙醇胺極性極為相近的縮醛磷脂酰乙醇胺 (pPE)[11]。對(duì)刺參性腺磷脂組成的分析還有待進(jìn)一步研究。

      3 討論

      海參性腺是一種珍貴的食材。研究發(fā)現(xiàn),刺參性腺脂質(zhì)的脂肪酸組成中不飽和脂肪酸達(dá)到73.2%[12],而其中的脂質(zhì)又多以磷脂的形式存在,因此,對(duì)刺參性腺中磷脂的研究具有重要的意義。磷脂本身作為功能性脂質(zhì),在生命代謝活動(dòng)中有極其重要的作用,可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,降低血脂中甘油三酯和膽固醇水平。多烯磷脂酰膽堿為磷脂的一種,已在臨床上作為肝病輔助治療藥得到廣泛利用[13],磷脂生物活性包括減肥、抗癌、降血糖等[14-16],也必將越來(lái)越受到人們的重視。

      對(duì)于刺參性腺所含磷脂的分析方法,從分離體系來(lái)看,正相整體硅膠柱由整片硅膠制成,不同于傳統(tǒng)硅膠柱由硅膠顆粒填充,因此,整體柱在一定程度上可以避免柱床塌陷的問(wèn)題。而且整體柱具有更高的孔隙度 (20 nm的大孔徑和13 nm的中孔徑),允許流動(dòng)相在低壓下獲得很高的流速,最高可達(dá)9.0 mL/min,且不容易發(fā)生堵塞柱子的情況[5]。國(guó)外已有學(xué)者將整體柱用于磷脂的分析[5,7,17],國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中,利用正相整體硅膠柱為固定相,正己烷-異丙醇-乙酸水體系為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,與國(guó)內(nèi)外常用的磷脂分析方法相比,該方法可以在15 min內(nèi)對(duì)6種磷脂組分同時(shí)進(jìn)行分析,且分離效果良好,也可以應(yīng)用于其他來(lái)源的磷脂成分檢測(cè)。

      [1]Sun Weihong,Leng Kailiang,Lin Hong,et al.Analysis and evaluation of chief nutrient composition in different parts of Stichopus japonicus[J].Chinese Journal of Animal Nutrition,2010,22(1):212-220.

      [2]王琦.海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)源n-3PUFA磷脂的提取及生物活性研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2008.

      [3]姚凱,薛蕓,李靜,等.磷脂分析方法的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,15(14):2972-2975.

      [4]朱超.基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的磷脂組學(xué)平臺(tái)的建立、改進(jìn)及應(yīng)用[D].上海:華東理工大學(xué),2011.

      [5]Graeve M,Janssen D.Improved separation and quanti fi cation of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase:application to exceptional marine lipids[J].Journal of Chromatography B,2009,877:1815-1819.

      [6]曹棟.HPLC-ESLD法分離測(cè)定大豆磷脂酰膽堿[J].中國(guó)油脂,2005,30(12):43-45.

      [7]Narváez-Rivas M,Gallardo E,Ríos J J,et al.A new high performance liquid chromatographic method with evaporative light scattering detector for the analysis of phospholipids:application to iberian pig subcutaneous fat[J].Journal of Chromatography A,2011,1218(22):3453-3458.

      [8]Folch J,Lees M,Stanley G H S.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].Journal of Biological Chemistry,1957,226:497-509.

      [9]Kadri N,Khettal B,Yahiaoui-zaidi R,et al.Analysis of polar lipid fraction of Pinus halepensis Mill.seeds from North Algeria[J].Industrial Crops and Products,2013,51:116-122.

      [10]Kielbowicz G,Micek P,Wawrzeńczyk C.A new liquid chromatography method with charge aerosol detector(CAD)for the determination of phospholipid classes.Application to milk phospholipids[J].Talanta,2013,105:28-33.

      [11]Boselli E,Pacetti D,Curzi F,et al.Determination of phospholipid molecular species in pork meat by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and evaporative light scattering detection[J].Meat Science,2008,78:305-313.

      [12]張健,王茂劍,馬晶晶,等.仿刺參生殖腺營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].食品科學(xué),2013,34(14):232-236.

      [13]何俊婷.多烯磷脂酰膽堿分離與制劑工藝研究[D].西安:西北大學(xué),2011.

      [14]劉艷青.皺紋盤(pán)鮑地域及季節(jié)性差異分析及內(nèi)臟磷脂減肥活性研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2013.

      [15]馬琴.二十二碳六烯酸-磷脂生物活性的研究[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2009.

      [16]胡世偉,王靜鳳,徐雷雷,等.海參磷脂型二十碳五烯酸降血糖作用機(jī)制的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2013,35(5):445-449.

      [17]Gerits L R,Pareyt B,Delcour J A.Single run HPLC separation coupled to evaporative light scattering detection unravels wheat fl our endogenous lipid redistribution during bread dough making[J].LWT-Food Science and Technology,2013,53:426-433.

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