王慶鈞，谷越，楊穎，汪秋寬，宋悅凡，何云海，任丹丹，叢?；?/p>

(大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國(guó)家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023)

萱藻Scytosiphon lomentaria隸屬于褐藻門，廣泛分布于中國(guó)遼東半島到海陵島之間的沿海地區(qū)，屬于溫帶性海藻［1］。萱藻藻體的生長(zhǎng)方式為單條叢生，每條長(zhǎng)度為15～70 cm，在幼體時(shí)藻體為實(shí)心，長(zhǎng)到成體時(shí)變成空心，藻體呈節(jié)狀，是一種重要的海藻資源［2］。

據(jù)報(bào)道，萱藻中含有巖藻聚糖硫酸酯［3-5］，巖藻聚糖硫酸酯具有降血脂、抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、降血糖等多種生物活性物質(zhì)［3-9］。本研究中，采用正交試驗(yàn)法對(duì)萱藻中巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究其保肝護(hù)肝作用，旨在為萱藻的高效綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮萱藻購(gòu)自大連市黑石礁市場(chǎng)。清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶均購(gòu)自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，山梨醇購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，聯(lián)苯雙酯滴丸購(gòu)自北京協(xié)和藥廠。乙醇為95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的食用乙醇，其他試劑均為分析純。谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、乳酸脫氫酶 (LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、微量還原型谷胱甘肽 (GSH)和蛋白定量測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1．2．1 萱藻水分的測(cè)定參照 GB/T 5009．3—2003［10］，采用直接干燥的方法測(cè)定水分含量。

1．2．2 巖藻聚糖硫酸酯提取工藝的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取萱藻，加入至萱藻干基18倍的水，用高速組織搗碎機(jī)搗碎，使用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶(三者的質(zhì)量比為4∶3∶2)，在不同的加酶量、酶解時(shí)間、pH和酶解溫度下進(jìn)行酶解，然后將其置于沸水中抽提2 h，降至室溫后離心，得上清液。在上清液中加入乙醇，至乙醇含量為20%，離心，去掉溶液中的絮狀沉淀，得上清液;在該上清液中加入乙醇，至乙醇含量為60%，產(chǎn)生白色沉淀后，離心得到沉淀，即為巖藻聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品。將得到的巖藻聚糖硫酸酯粗產(chǎn)品加水溶解，在溶液中加入乙醇至乙醇含量為30%，溶液中產(chǎn)生少許不溶物，離心除去不溶物，得上清液;再加入乙醇，至乙醇含量為70%，溶液中有白色沉淀產(chǎn)生時(shí)，用無(wú)水乙醚洗滌沉淀，經(jīng)冷凍干燥得白色粉末即為巖藻聚糖硫酸酯粗提物［11］。

1．2．3 硫酸根和多糖含量的測(cè)定 采用鹽酸水解-硫酸鋇重量法測(cè)定硫酸根含量［12］，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量［13］。

1．2．4 巖藻聚糖硫酸酯對(duì)四氯化碳 (CCl4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用 將60只體質(zhì)量為(18±2)g的清潔級(jí)雌性昆明小鼠，隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組［劑量為300 mg/(kg·d)］、萱藻巖藻聚糖硫酸酯(F)低劑量組［100 mg/(kg·d)］、F中劑量組［300 mg/(kg·d)］、F高劑量組［500 mg/(kg·d)］，每組放10只小鼠。連續(xù)10 d給小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，然后對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組和F劑量組小鼠進(jìn)行灌胃，每只每天灌胃規(guī)定劑量。末次灌胃2 h后，給空白對(duì)照組小鼠腹腔注射植物油，給其他5組小鼠按10 mL/kg(體質(zhì)量)的劑量腹腔注射含0．4%CCl4的植物油溶液［9］。小鼠禁食24 h后，從眼球取血，脫頸處死小鼠，取肝臟稱重。血液經(jīng)3000 r/min離心15 min得到上清，用試劑盒測(cè)定AST、ALT、LDH活性。肝臟取相同部位約0．3 g，加入冰生理鹽水進(jìn)行勻漿，配制成10%肝組織勻漿液，剩余的肝臟放入甲醛中浸泡，制成肝切片后用顯微鏡進(jìn)行觀察。用試劑盒測(cè)定肝臟勻漿液中的GSH、MDA、SOD值，并計(jì)算肝臟指數(shù):

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量 (g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用 SPSS 17．0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0．05，極顯著性水平為 0．01。

2 結(jié)果與分析

2.1 萱藻水分

利用直接干燥法測(cè)得新鮮萱藻的水分含量為(90．62±0．003)%。

2.2 萱藻中巖藻聚糖硫酸酯提取工藝的優(yōu)化

在料液比為1∶18(質(zhì)量比)的萱藻水提取液中，加入纖維素混合酶，以巖藻聚糖硫酸酯的提取率 (提取率=巖藻聚糖硫酸酯/原料干質(zhì)量×100%)、硫酸根含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)L9(34)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor and level table in an orthogonal test factors

表2 萱藻中巖藻聚糖硫酸酯提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of the fucoidan extraction from seaweed Cytosiphon Iomentaria

由表2可知，以巖藻聚糖硫酸酯提取率為指標(biāo)時(shí)，由R值得知，各因素的影響能力依次為酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶加量＞pH，最優(yōu)組合為A2B2C1D3;以含量為指標(biāo)時(shí)，由R'值得知，各因素的影響能力依次為酶加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞pH，最優(yōu)組合為A1B1C2D1。

從9組正交試驗(yàn)中得出提取率最優(yōu)組為8號(hào)，即 A3B2C1D3，含量最優(yōu)組為1號(hào)，即A1B1C1D1。試驗(yàn)結(jié)果與用極差分析得到的理論值結(jié)果不一致，因此，分別對(duì)A2B2C1D3、A1B1C2D1和實(shí)際的最優(yōu)組A3B2C1D3、A1B1C1D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 萱藻中巖藻聚糖硫酸酯提取的正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Verification test of the fucoidan extracting in an orthogonal experiment

從表3可見:提取率最高的組為A3B2C1D3，為6．81%，但是在此條件下含量較低;含量最高的組為A1B1C2D1，為27．50%，但是在此條件下提取率不高;綜合考慮，A2B2C1D3組的提取率和硫酸根含量都接近最高值，所以確定A2B2C1D3組為最優(yōu)組。因此，本試驗(yàn)中條件下，確定萱藻中巖藻聚糖硫酸酯的最佳提取工藝:料液比為1∶18，纖維素酶混合酶酶加量為2．95%，酶解溫度為50℃，pH為5．5，酶解時(shí)間為60 min，在此條件下，巖藻聚糖硫酸酯的提取率為4．28%，含量為26．04%。

2.3 萱藻中巖藻聚糖硫酸酯對(duì)CCl4造成的急性肝損傷小鼠生化指標(biāo)的影響

2．3．1 小鼠血清中AST、ALT、LDH活性 從表4可見:注射CCl4后，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中AST、ALT和LDH活性均極顯著升高(P＜0．01)，說(shuō)明CCl4對(duì)小鼠的肝臟造成了破壞，建模成功;與模型組相比，灌胃巖藻聚糖硫酸酯的各劑量組和聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組小鼠血清中的AST、ALT和LDH活性均極顯著下降 (P＜0．01)，但各劑量組與聯(lián)苯雙脂陽(yáng)性組之間均無(wú)明顯差異 (P＞0．05)。

表4 小鼠血清AST、ALT、LDH活性的變化 (n=10)Tab.4 Changes in ALT，AST and LDH activities in mice serum(n=10) U/L

2．3．2 小鼠肝臟中MDA、GSH含量和SOD活性從表5中可見，注射CCl4后，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中MDA含量和肝臟指數(shù)均極顯著升高 (P＜0．01)，GSH含量顯著降低 (P＜0．05)，SOD活性極顯著降低 (P＜0．05)，說(shuō)明小鼠肝臟遭到破壞，建模成功;與模型組相比，灌胃巖藻聚糖硫酸酯的各劑量組和聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組的MDA含量和肝臟指數(shù)均有降低，除聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組、F低劑量組與模型組的肝臟指數(shù)無(wú)顯著差異外(P＞0．05)，其余組均與模型組的MDA含量及肝臟指數(shù)有顯著性差異 (P＜0．05);SOD活性均顯著升高 (P＜0．05)，F(xiàn)低劑量組SOD活性的升高效果好于F高劑量組和F中劑量組，GSH含量均有升高，僅聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組和F高劑量組與模型組有顯著性差異 (P＜0．05)。這表明，萱藻巖藻聚糖硫酸酯對(duì)小鼠肝臟有顯著的保護(hù)作用。

綜上所述，從萱藻中提取的巖藻聚糖硫酸酯可以抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，具有一定抗氧化和清除自由基的能力，可以提高GSH含量和SOD活性，具有顯著的保肝護(hù)肝作用。

2．3．3 小鼠肝臟的組織學(xué)觀察 從圖1可以看出:空白對(duì)照組的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞完整，形態(tài)正常，可見清晰的細(xì)胞核;CCl4模型組的中央靜脈周圍細(xì)胞出現(xiàn)大面積壞死，細(xì)胞破裂成條狀，細(xì)胞核消失，排列紊亂，說(shuō)明小鼠肝臟遭到破壞，建模成功;與模型組相比，F(xiàn)低劑量組中央靜脈周圍的細(xì)胞壞死且明顯減少，多數(shù)細(xì)胞完整，形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組和F中劑量組、F高劑量組與空白對(duì)照組相近。從光學(xué)顯微鏡下觀察到的組織學(xué)形態(tài)可以得出，萱藻中的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。

表5 小鼠肝臟MDA、GSH含量和SOD活性的變化 (n=10)Tab.5 Changes in MDA and GSH contents，and SOD activity in livers of a mice(n=10)

圖1 光學(xué)顯微鏡 (400×)下CCl4致肝損傷的肝組織切片照片F(xiàn)ig.1 A photomicrograph of(400×)injury liver induced by CCl4under a light microscope

3 討論

巖藻聚糖硫酸酯存在于海藻細(xì)胞的細(xì)胞壁基質(zhì)中，添加的纖維素混合酶主要用于分解細(xì)胞壁。萱藻中富含果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)，在浸提過(guò)程中會(huì)增加浸提液的黏稠度［14］，使巖藻聚糖硫酸酯不易溶出。針對(duì)巖藻聚糖硫酸酯的以上特點(diǎn)，本研究中優(yōu)化了萱藻中巖藻聚糖硫酸酯的提取工藝，得到最優(yōu)條件為料液比1∶18，纖維素混合酶酶加量為2．95%，酶解溫度為 50℃，pH為 5．5，酶解時(shí)間為 60 min。在此條件下，巖藻聚糖硫酸酯的提取率為4．28%，含量為26．04%。

本試驗(yàn)中對(duì)CCl4造成的急性肝損傷小鼠模型研究結(jié)果表明，巖藻聚糖硫酸酯能夠顯著抑制小鼠血清中ALT、AST、LDH活性的升高以及肝組織中MDA含量、肝臟指數(shù)的升高，提高小鼠體內(nèi)的SOD活性和GSH含量。與模型組相比，F(xiàn)中劑量組、F高劑量組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低，說(shuō)明巖藻聚糖硫酸酯顯著降低了由CCl4造成的急性肝損傷，根據(jù)小鼠肝損傷后的肝組織切片也可以得出此結(jié)論。

ALT主要存在于細(xì)胞漿中，AST主要存在于細(xì)胞漿的線粒體中。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，ALT首先進(jìn)入血液中，當(dāng)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷危及線粒體時(shí)，AST也會(huì)進(jìn)入血液中。LDH是糖酵解過(guò)程中一種重要的酶，任何原因引起的肝細(xì)胞損傷均可使LDH逸出，引起血清中LDH活力增加。MDA是膜脂過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，其含量的高低可以作為考察細(xì)胞受到脅迫嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，它的主要傷害是導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu) (主要是細(xì)胞質(zhì)膜)，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行。與模型組相比，F(xiàn)劑量組血清中ALT、AST、LDH活性均顯著降低，肝臟中MDA含量顯著降低，說(shuō)明巖藻聚糖硫酸酯顯著降低了由CCl4造成的小鼠急性肝損傷中肝細(xì)胞的損傷程度，并且降低了肝細(xì)胞膜的損傷。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。GSH為解除毒素的特效物質(zhì)，是一種由三個(gè)氨基酸組成的小分子肽，為動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑。與模型組相比，F(xiàn)劑量組肝臟中SOD和GSH含量的顯著升高，說(shuō)明巖藻聚糖硫酸酯可能是通過(guò)增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力，抑制自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)肝臟免受損傷。

綜上所述，萱藻中巖藻聚糖硫酸酯具有顯著的保護(hù)肝臟作用，能顯著降低由CCl4造成的急性肝損傷，降低肝細(xì)胞和肝細(xì)胞膜的損傷程度，作用機(jī)理可能是通過(guò)增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力，抑制自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而保護(hù)肝臟免受損傷。確切的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探明。

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