左麗云，趙　淳，樂　薇，吉瑞冬，孫　雯，吳士筠

(武漢工商學(xué)院，湖北 武漢 430065)

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響應(yīng)面法優(yōu)化箬葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝

左麗云，趙淳，樂薇，吉瑞冬，孫雯，吳士筠

(武漢工商學(xué)院，湖北 武漢 430065)

摘要：采用大孔樹脂純化箬葉總黃酮。由靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)篩選出最佳樹脂，在動(dòng)態(tài)吸附與解吸單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化箬葉總黃酮的大孔樹脂純化工藝條件。結(jié)果表明：HPD-800樹脂對(duì)箬葉總黃酮的吸附容量最大，上樣液pH值為9，上樣液濃度為2.3 mg·mL-1，上樣流速為1.0 mL·min-1,用4 BV 80%乙醇以3 BV·h-1速度洗脫，解吸率為84.62%。

關(guān)鍵詞：箬葉；總黃酮；純化；大孔樹脂；響應(yīng)面法

箬葉是禾本科竹亞科箬竹屬植物葉的總稱，它含有多種生物活性成分，如黃酮、活性多糖、維生素、微量元素、揮發(fā)油、芳香成分、茶多酚等[1-2]。箬葉總黃酮有很好的清除體內(nèi)自由基[3]、抗氧化和衰老、提高免疫力、抗菌、抗病毒[4]等作用。從植物體中提取高純度的天然黃酮類物質(zhì)引起了研究者的廣泛關(guān)注，已成為藥物研發(fā)與利用的熱點(diǎn)[5]。大孔樹脂是一種吸附能力很強(qiáng)的吸附劑，具有吸附選擇性好、熱穩(wěn)定性好、再生處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，尤其適合黃酮類化合物的純化[8-10]。作者在此采用大孔樹脂純化箬葉總黃酮，并通過響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，擬為箬葉的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

箬葉，采集于湖北宜昌長(zhǎng)陽土家族自治縣，洗凈晾干后儲(chǔ)藏備用；大孔樹脂AB-8、D-101、D-301、HPD-600、HPD-800，華南理工大學(xué)振華有限公司。

無水乙醇、石油醚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉，天津天力化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

BSZ-160型自動(dòng)部分收集器，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.2　方法

1.2.1大孔樹脂預(yù)處理

大孔樹脂預(yù)處理參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.2.2箬葉總黃酮提取液的制備

取一定量的箬葉粉碎后置于石油醚中浸泡24 h，去色素。以70%乙醇為提取劑，按料液比1∶20(g∶mL，下同)于60 ℃提取 2 h，抽濾，濃縮至無沉淀，即得箬葉總黃酮提取液。

1.2.3箬葉總黃酮濃度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg溶于30%乙醇中，并定容至100 mL。用移液管分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL容量瓶中；加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，靜置6 min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，以30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min；測(cè)定510 nm處吸光度，參比為不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確移取1.00 mL箬葉總黃酮提取液于10 mL容量瓶中，按上述方法加入各種試劑，以不加箬葉總黃酮提取液的溶液為參比，測(cè)定510 nm處吸光度。依標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算箬葉總黃酮濃度。

1.2.4大孔樹脂純化工藝條件的優(yōu)化

1.2.4.1大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

(1)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取預(yù)處理過的5種樹脂各1.00 g，加入一定濃度的箬葉總黃酮提取液，待吸附飽和后，測(cè)定剩余溶液中總黃酮濃度，按式(1)計(jì)算樹脂的靜態(tài)吸附容量(mg·g-1):

(1)

(2)靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗至流出液無色,濾紙吸干樹脂表面殘留液，加入20 mL 90%乙醇溶液，置于25 ℃、60 r·min-1搖床中解吸20 h，濾出樹脂，測(cè)定解吸液中總黃酮濃度，按式(2)計(jì)算靜態(tài)解吸率:

(2)

1.2.4.2大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附與解吸

(1)動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

將預(yù)處理好的HPD-800樹脂裝入層析柱中，柱床體積為16 mL，將箬葉總黃酮提取液以1.0 mL·min-1的流速上樣，每3 mL收集流出液，測(cè)定總黃酮濃度。找出泄漏液總黃酮濃度為上樣液濃度的1/10的泄漏液體積[12],按式(3)計(jì)算樹脂的動(dòng)態(tài)吸附容量(mg·g-1)：

(3)

(2)動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

將上述吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗至流出液無色，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇以不同流速洗脫，每3 mL收集洗脫液，測(cè)定總黃酮濃度，按式(4)計(jì)算動(dòng)態(tài)解吸率：

(4)

1.2.4.3響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)確定最佳樹脂、動(dòng)態(tài)吸附與解吸單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化箬葉總黃酮純化工藝。

2結(jié)果與討論

2.1　大孔樹脂的篩選

比較了5種樹脂(AB-8、D-101、D-301、HPD-600、HPD-800)對(duì)箬葉總黃酮的靜態(tài)吸附容量與靜態(tài)解吸率，結(jié)果見圖1。

從圖1可看出，5種樹脂都可以吸附箬葉總黃酮，其中HPD-800的靜態(tài)吸附容量最大，靜態(tài)解吸率也相對(duì)較高。因此，選擇HPD-800樹脂純化箬葉總黃酮。

2.2　上樣液pH值的確定

由于箬葉總黃酮在酸性和中性條件下溶解度較小，故僅考察其在堿性條件下的影響。比較了上樣液pH值分別為7、8、9、10、11、12時(shí)的靜態(tài)吸附容量，結(jié)果見圖2。

圖1　5種樹脂的靜態(tài)吸附容量(a)和靜態(tài)解吸率(b)Fig.1　Static adsorption capacity(a) and static desorption rate(b) of five kinds of resin

圖2　不同pH值下的靜態(tài)吸附容量Fig.2　Static adsorption capacity underdifferent pH values

從圖2可看出，上樣液pH值為9時(shí)的靜態(tài)吸附容量最大。因此，選擇上樣液pH值為9。

2.3　動(dòng)態(tài)吸附與解吸條件的確定

2.3.1上樣液濃度

取2 BV、pH值為9的不同濃度的箬葉總黃酮提取液通過HPD-800樹脂床，測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附容量，結(jié)果見圖3。

從圖3可看出，隨著上樣液(箬葉總黃酮提取液)濃度的增大，樹脂動(dòng)態(tài)吸附容量逐漸增大。由于箬葉總黃酮提取液濃縮至2.3 mg·mL-1后再進(jìn)一步濃縮有沉淀析出，故選擇上樣液濃度為2.3 mg·mL-1。

2.3.2上樣流速

圖3　不同上樣液濃度下的動(dòng)態(tài)吸附容量Fig.3　Dynamic adsorption capacity at differentconcentrations of sample solution

取2 BV、pH值為9、濃度為2.3 mg·mL-1的箬葉總黃酮提取液以不同流速通過HPD-800樹脂床，繪制泄漏曲線，測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附容量，結(jié)果見圖4。

圖4　不同上樣流速下的泄漏曲線(a)和動(dòng)態(tài)吸附容量(b)Fig.4　Leakage curves(a) and dynamic adsorption capacity(b) at different flow rates

從圖4可看出，隨著上樣流速的加快，動(dòng)態(tài)吸附容量逐漸減小。這是因?yàn)?，流速過快，樹脂還沒有充分吸附，箬葉總黃酮就已經(jīng)隨流出液流出。流速為0.5 mL·min-1和1.0 mL·min-1時(shí)的動(dòng)態(tài)吸附容量差別不大，考慮到流速慢耗時(shí)不經(jīng)濟(jì)，所以選擇上樣流速為1.0 mL·min-1。

2.3.3洗脫劑體積分?jǐn)?shù)

箬葉總黃酮難溶于水，易溶于乙醇等弱極性溶劑，故選擇乙醇作為洗脫劑。用不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇水溶液分別進(jìn)行洗脫，洗脫效果見表1。

表1　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下的解吸率Tab.1　Desorption rate of different volume fractions of ethanol

從表1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，動(dòng)態(tài)解吸率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，解吸率達(dá)到最高。因此，選擇洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.3.4洗脫流速

用70%乙醇水溶液以不同流速洗脫pH值為9的箬葉總黃酮提取液，測(cè)定洗脫液中總黃酮濃度，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖5。

圖5　不同洗脫流速下的洗脫曲線Fig.5　Elution curves at different elution flow rates

從圖5可看出，洗脫流速對(duì)總黃酮濃度的影響較大，流速越慢，洗脫峰拖尾越不明顯?？紤]到經(jīng)濟(jì)性與時(shí)效性，選擇洗脫流速為3 BV·h-1，此時(shí)洗脫效果好，洗脫劑用量少。

2.4　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化箬葉總黃酮純化工藝

2.4.1響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速、洗脫劑用量3個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化箬葉總黃酮純化工藝。響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2，結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表2　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.2　Factors and levels of response surface methodology

運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得出3個(gè)因素和解吸率之間的回歸關(guān)系式：解吸率=-117.28237+2.37789A+17.10325B+39.80475C+0.10413AB-0.15325AC+2.68750BC-0.012793A2-6.18950B2-4.27200C2。

從表4可知，該方程P<0.01，表明響應(yīng)回歸模型顯著，均方差R2=0.9292，表明 92.92% 的數(shù)據(jù)可以用此方程來解釋。所以可以用此方程來分析和預(yù)測(cè)大孔樹脂純化箬葉總黃酮的工藝條件。

表4　方差分析Tab.4　Variance analysis

2.4.2響應(yīng)曲面和等高線

解吸率對(duì)應(yīng)于洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速、洗脫劑用量所形成的三維空間曲面圖以及在二維平面上的等高線圖可直觀反映洗脫劑體積分?jǐn)?shù)、洗脫流速、洗脫劑用量以及它們之間的交互作用對(duì)解吸率的影響[13-14]。

利用Design Expert 8.0.6.1軟件分析得到的響應(yīng)曲面和等高線如圖6所示。

圖6　響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.6　Response surface and contour maps

由圖6a可以看出,洗脫劑體積分?jǐn)?shù)曲面較陡，表明洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)箬葉總黃酮的解吸率影響顯著；而洗脫流速曲面平緩，說明洗脫流速對(duì)解吸率影響不太顯著。從等高線圖上可看出，沿洗脫劑體積分?jǐn)?shù)軸向等高線變化密集，而洗脫流速軸向等高線稀疏，說明洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的峰值影響比洗脫流速大。

由圖6b可以看出,洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和洗脫劑用量的曲面都較陡，表明洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和洗脫劑用量對(duì)箬葉總黃酮的解吸率影響顯著。從等高線圖上可看出，沿洗脫劑體積分?jǐn)?shù)軸向等高線變化密集，而洗脫劑用量軸向等高線相對(duì)稀疏，說明洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率峰值影響較洗脫劑用量大，等高線呈橢圓形，說明洗脫劑體積分?jǐn)?shù)和洗脫劑用量間的交互作用較強(qiáng)[15-16]。

由圖6c可以看出,洗脫劑用量曲面較陡，表明洗脫劑用量對(duì)箬葉總黃酮的解吸率影響顯著，而洗脫流速對(duì)解吸率的影響則不太顯著。從等高線圖上可看出，沿洗脫劑用量和洗脫流速軸向等高線變化都不太密集，等高線呈橢圓形，說明洗脫劑用量和洗脫流速間的交互作用較強(qiáng)。

2.4.3回歸方程及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于0，整理可得如下方程：

2.37789+0.10413B-0.15325C-0.025586A=0

17.10325+0.10413A+2.68750C-12.37900B=0

39.80475-0.15325A+2.68750B-8.54400C=0

聯(lián)立以上方程組解得A=80.83、B=2.93、C=4.01,對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件為：洗脫劑體積分?jǐn)?shù)80.83%、洗脫流速2.93 BV·h-1、洗脫劑用量4.01 BV。采用最優(yōu)純化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為便于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行將純化條件修改為：洗脫劑體積分?jǐn)?shù)80%、洗脫流速3 BV·h-1、洗脫劑用量4 BV，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的吸附容量為11.09 mg·g-1，解吸率為84.62%，與響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)所得解吸率85.75%相差不大。

3結(jié)論

HPD-800樹脂對(duì)箬葉總黃酮的吸附容量大，易于解吸，適合于對(duì)箬葉總黃酮的分離純化。響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)純化工藝條件為：吸附過程：常溫，pH值9，流速1.0 mL·min-1，上樣液濃度2.3 mg·mL-1；解吸過程：4 BV 的80%乙醇以3 BV·h-1流速進(jìn)行洗脫。在上述條件下HPD-800樹脂對(duì)箬葉總黃酮的吸附容量為11.09 mg·g-1，解吸率為84.62%。表明，采用HPD-800樹脂對(duì)箬葉總黃酮的純化效果好，可以考慮應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。

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10.3969/j.issn.1672-5425.2015.12.008

Optimization on Purification Process of Total Flavonoids from Indocalamus

Leaves with Macroporous Resins by Response Surface Methodology

ZUO Li-yun，ZHAO Chun，YUE Wei，JI Rui-dong，SUN Wen，WU Shi-jun

(Wuhan Technology and Business University，Wuhan 430065,China)

Abstract：Total flavonoids from indocalamus leaves were purified by macroporous resins.The optimal macroporous resin was choosen by static adsorption-desorption experiment.Based on dynamic adsorption-desorption experiment，the purification process of total flavonoids from indocalamus leaves with macroporous resins was optimized by response surface methodology.Results showed that，resin HPD-800 had higher adsorption capacity，the pH value of sample solution was 9,the concentration of sample solution was 2.3 mg·mL-1，the flow rate of sample was 1.0 mL·min-1.When using 4 BV ethanol(volume fraction of 80%) as eluent with 3 BV·h-1，the desorption rate was 84.62%.

Keywords：hydrotalcite-like;octyl betaine;cyclohexanone;dehydrogenation;catalytic performancedoi：

中圖分類號(hào)：TQ 028R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2015)12-0033-05

通訊作者：

作者簡(jiǎn)介：左麗云，女，湖北廣水人，研究方向：天然產(chǎn)物提取與分離；樂薇，副教授，E-mail：yuewei11@126.com。

收稿日期：2015-09-19

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013C111)，武漢工商學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(S201415)