孟麗娟，　王　峻，　樊衛(wèi)飛，　蒲驍麟，　許菊青，　王　琳，　楊　民，　劉福銀

miR-17-5P對(duì)肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1和GLC-82的增殖及侵襲能力的影響

孟麗娟，王峻，樊衛(wèi)飛，蒲驍麟，許菊青，王琳，楊民，劉福銀

【摘要】目的探討miR-17-5P對(duì)肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1及GLC-82增殖及侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。方法利用化學(xué)合成的miR-17-5P mimics及miR-17-5P inhibitor轉(zhuǎn)染A549、SPCA-1及GLC-82肺癌細(xì)胞株，通過(guò)MTT、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)miR-17-5P后細(xì)胞遷移、侵襲能力及生長(zhǎng)的變化；Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期、上皮間葉轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)志物相關(guān)蛋白。結(jié)果MTT法顯示，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)miR-17-5P組細(xì)胞生長(zhǎng)速度增加(P<0.001)；miR-17-5P表達(dá)抑制后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低(P<0.001)。Transwell及Boyden實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)組細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜的數(shù)量多于對(duì)照組(P<0.001)，抑制表達(dá)后細(xì)胞穿膜數(shù)減少，并少于對(duì)照組(P<0.001)。Western blot示，與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞中，CCND1、N-CA、Vimentin表達(dá)上調(diào)，抑制miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞中，CCND1、N-CA、Vimentin表達(dá)下調(diào)。結(jié)論miR-17-5P可能通過(guò)上調(diào)CCND1、Vimentin、N-CA促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1及GLC-82的增殖、遷移及侵襲。

【關(guān)鍵詞】miR-17-5P；肺癌；增殖；侵襲

The impose of miR-17-5P over cell proliferation and invasion in lung cancer cells A549, SPCA-1 and GLC-82MENGLijuan,WANGJun,FANWeifei,PUXiaolin,XUJuqing,WANGLin,YANGMin,LIUFuyin.(DepartmentofHematologyandOncology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China)

Correspondingauthor:WANGJun,E-mail:madam_wangjun@163.com

Abstract：ObjectiveThe aim of this study was to investigate the effect and molecular mechanism of miR-17-5P over cell proliferation and invasion in lung cancer cells A549 , SPCA-1 and GLC-82.MethodsmiR-17-5P mimics and inhibitor were synthesized and transfected into lung cancer cells A549, SPCA-1 and GLC-82. The abilities of cell growth，migration and invasion were examined by MTT，Transwell， and Boyden chamber. Westen blot was used to test the expression of cell cycle and EMT-associated proteins.ResultsCompared with the control group，over expression of miR-17-5P improved A549, SPCA-1 and GLC-82 cells growth and number across polycarbonate membrane(P<0.001). While miR-17-5P expression was inhibited, cells growth and number across polycarbonate membrane were improved(P<0.001). Over expression of miR-17-5P upregulate the expression of CCND1，Vimentin and N-CA in A549, SPCA-1 and GLC-82. Meantime, expression of CCND1，Vimentin and N-CA was downgraded when expression of miR-17-5P was inhibited. ConclusionmiR-17-5P may facilitate cell proliferation, migration and invasion in A549 , SPCA-1 and GLC-82, by which mechanism is related to the improvement of expression of CCNDl，Vimentin and N-CA．

Keywords：miR-17-5P；lung cancer；proliferation；invasion

抽樣調(diào)查顯示，1988年至2005年間，我國(guó)肺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，年平均增長(zhǎng)1.63%，其中男性為1.30%，女性為2.34%[1]。microRNAs(miRNAs)是一類進(jìn)化上保守的內(nèi)生的長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，具有在翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)的功能。據(jù)推測(cè)，miRNA調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。miR-17-5p與多種腫瘤發(fā)病相關(guān)，在肺癌中亦過(guò)表達(dá)。本文通過(guò)MTT、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-17-5p在肺癌細(xì)胞株中增殖及侵襲能力，利用Westen blot檢測(cè)細(xì)胞周期、上皮間葉轉(zhuǎn)變(EMT)標(biāo)志物相關(guān)蛋白來(lái)探討其在肺癌發(fā)病中的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1肺癌細(xì)胞株肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1及GLC-82均由南京醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)。肺癌細(xì)胞株SPCA-1和GLC-82采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，A549細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。分別在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。文中過(guò)表達(dá)miR-17-5P的細(xì)胞株分別表示為miR-17-5P mimics A549、miR-17-5P mimics SPCA-1及miR-17-5P mimics GLC-82，miR-17-5P表達(dá)抑制的細(xì)胞株分別表示為miR-17-5P inhibitor A549、miR-17-5P inhibitor SPCA-1及miR-17-5P inhibitor GLC-82，對(duì)照組細(xì)胞株分別以NC-A549、NC-SPCA-1及NC-GLC-82表示。

1.1.2主要試劑Opti-MEM、RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)HyClone公司)； TurboFect siRNA Transfection Reagent( Fermentas公司)；Transwell小室(孔徑8μm，Corning公司)；瑞氏-吉姆薩染色試劑盒(廣州儷科貿(mào)易有限公司)；二甲基四氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)( Amersco公司)：RIPA、PMSF蛋白裂解液(上海閃晶分子生物科技公司)；細(xì)胞周期相關(guān)抗體(Santacmz公司)；EMT相關(guān)標(biāo)志物抗體(美國(guó)cell Signaling Technology 公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Millipore公司)。β-actin(鼠抗)、HRP標(biāo)記的抗鼠二抗、抗兔二抗(南京生興生物)。

1.1.3主要儀器和設(shè)備CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；垂直凝膠電泳系統(tǒng)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1miRNA mimics和inhibitormiR-17-5P mimics和inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。miR-17-5P mimics序列為：CAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG；miR-17-5P inhibitor序列為：CUA CCU GCA CUG UAA GCA CUU UG。

1.2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照廣州銳博生物技術(shù)公司mimicsRNA的操作說(shuō)明進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d，分別接種約2×105A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞于6孔板中，在細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%匯合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入1 500μl完全培養(yǎng)基。將5μl 20μmol/L has-miR-17-5P mimics加入到250μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕柔混勻；另用250μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋1μl TurboFect siRNA Transfection Reagent，輕柔混勻，室溫孵育5 min；混合Opti-MEM-脂質(zhì)體與Opti-MEM-mimics，室溫孵育20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；然后將上述混合物加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻。在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。最終mimics終濃度為50 nmol/L，每孔總液體量為2 ml。48 h收集細(xì)胞行Transwell小室遷移和Borden小室侵襲實(shí)驗(yàn)，72 h提蛋白。

miR-17-5P inhibitor轉(zhuǎn)染時(shí)20 μmol/L has-miR-17-5P inhibitor用量為10 μl，最終inhibitor終濃度為100 nmol/L，每孔總液體量為2 ml，余步驟同mimicsRNA轉(zhuǎn)染。

1.2.3噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)miR-17-5P對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響以每孔3.5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200 μl，每組5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照(僅加培養(yǎng)基)，分別連續(xù)培養(yǎng)3 d。每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μl，室溫孵育10 min，微振蕩器振蕩10 min。使結(jié)晶物充分溶解，以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處細(xì)胞吸光度值(A值)，以相應(yīng)的A比值表示細(xì)胞生長(zhǎng)能力。各組取5個(gè)孔平均值，重復(fù)3次，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前將小室取出，加入300 μl無(wú)血清培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，使聚碳酸酯膜親水。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的培養(yǎng)細(xì)胞用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。加100 μl細(xì)胞懸液于內(nèi)室，然后加500 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基于下室，37℃培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽輕輕擦掉未穿過(guò)膜的細(xì)胞，甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥，用Giemsa染液染色5 min。用蒸餾水輕輕地沖洗數(shù)次，空氣中風(fēng)干。用刀片小心切下聚碳酸酯膜，置于載玻片上。中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.5Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)每個(gè)小室matrigel基質(zhì)膠1.62 μl/孔，無(wú)血清培基43.37 μl/孔，37℃培養(yǎng)箱中放置4 h，備用。其余步驟同Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Westen blot檢測(cè)細(xì)胞周期、EMT標(biāo)志物相關(guān)蛋白的變化配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠，取30 μg蛋白質(zhì)，與4×SDS上樣緩沖液按體積比3∶1混合，金屬浴10 min，冰上放置2 min，加樣、電泳，濃縮膠80 V電泳30 min，分離膠100 V電泳90 min。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，350 mA，90～120 min。轉(zhuǎn)膜成功后進(jìn)行免疫雜交。先從轉(zhuǎn)印夾層中取出PVDF膜，放入裝有封閉液(含5%BSA的TBST)的平皿中浸泡，室溫孵育1 h。用封閉液稀釋一抗，再加目的基因單克隆抗體(用封閉液1∶1 000稀釋)和β-actin鼠抗人單克隆抗體(用封閉液1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h后4℃孵育過(guò)夜。次日取出膜，用TBST洗膜3次，每次5 min。分別加入HRP標(biāo)記的抗兔、抗鼠二抗(體積比1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，膜稍滴干后置于暗盒內(nèi)，加入化學(xué)發(fā)光試劑孵育。迅速曝光，曝光時(shí)間為10 s～1 min。高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描記錄。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1miR-17-5P mimics及inhibitor轉(zhuǎn)染成功后miR-17-5P表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-17-5P mimics后細(xì)胞株中miR-17-5P表達(dá)均顯著升高；轉(zhuǎn)染miR-17-5P inhibitor后miR-17-5P表達(dá)均顯著受抑(P<0.001)(圖1)。

**：與對(duì)照組相比，P<0.001。

與未轉(zhuǎn)染miR-17-5P mimics的對(duì)照細(xì)胞相比,過(guò)表達(dá)miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞體外增殖能力增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；轉(zhuǎn)染miR-17-5P inhibitor后，細(xì)胞體外增殖能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

**：與對(duì)照組相比，P<0.001。

2.2Trallswell小室檢測(cè)miR-17-5P對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-17-5P的細(xì)胞體外遷移能力增強(qiáng)，miR-17-5P表達(dá)抑制后細(xì)胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖3。

**：與對(duì)照組相比，P<0.001。

與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-17-5P的細(xì)胞體外侵襲能力增強(qiáng)，miR-17-5P表達(dá)抑制后細(xì)胞遷移能力減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖4。

**：與對(duì)照組相比，P<0.001。

以βactin為內(nèi)參，結(jié)果顯示：與對(duì)照細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)miR-17-5P的A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞中，CCND 1、N-CA、Vimentin表達(dá)均上調(diào)，P21、P15則無(wú)明顯變化。抑制miR-17-5P表達(dá)的A549、SPCA-1及GLC-82細(xì)胞中，CCND 1、N-CA、Vimentin表達(dá)均下調(diào)，P21、P15則無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖5。

**：與對(duì)照組相比，P<0.001。

圖5Westen blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)miR-17-5P后，A549、SPCA-1及

GLC-82細(xì)胞中CCND 1、P21、P15、N-CA、Vimentin蛋白的表達(dá)情況

3討論

肺癌是當(dāng)今世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年大約130萬(wàn)患者死于肺癌，位于癌癥病死的首位。研究顯示肺癌5年存活率僅17.1%[2]。近年來(lái)，miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控因子，其重要性和普遍性逐漸被人們認(rèn)識(shí)，越來(lái)越受到關(guān)注。microRNAs (miRNAs)是一類最新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子RNA，可調(diào)控大量編碼蛋白基因的表達(dá)，他主要通過(guò)與靶標(biāo)基因3’UTR的完全或不完全配對(duì)，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)。miRNAs可通過(guò)調(diào)控其靶標(biāo)基因參與的信號(hào)通路，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNAs失調(diào)在腫瘤中起重要作用[3-4]。

miR-17-5p屬于 miR-17-92簇。miR-17-92簇定位于人類染色體13q31-q32上，位于一個(gè)具有開(kāi)放讀碼框的基因C13 or f25內(nèi)，編碼7個(gè)miRNAs：miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1。miR-17-92簇受原癌基因Myc調(diào)控，具有癌基因和抑癌基因的雙重功能。文獻(xiàn)表明miR-17-92主要通過(guò)抑制促凋亡因子Bim、細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN1/P21、腫瘤抑制基因PTEN以及TGFβ信號(hào)通路等靶基因發(fā)揮作用，但在不同類型的腫瘤中所起作用的關(guān)鍵靶基因不一致。雖然上述報(bào)道證實(shí)miR-17-92簇具有原癌基因的功能，但在16.5%卵巢癌、21.9%乳腺癌和20%黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了因13q31.3位點(diǎn)雜合型缺失(loss-of- heterozygosity，LOH)而引起miR-17-92簇缺失。過(guò)表達(dá)miR-17的乳腺癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖受抑制，且miR-17/20可抑制乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。由此反映了miR-17-92簇功能的復(fù)雜性和多面性，提示其在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的功能。有研究顯示，在細(xì)胞龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-17-5p是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[5]。

miR-17-5p在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌及胃癌等多種腫瘤中異常表達(dá)[6-11]。Ebi等[6]發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌中miR-17-5p和miR-20a過(guò)表達(dá)。在肺鱗癌組織中miR-17-92表達(dá)明顯高于正常肺組織[7]。Matsubara等[12]發(fā)現(xiàn)在miR-17-92簇高表達(dá)的細(xì)胞肺癌株中，應(yīng)用miR-17-5p和miR-20a抑制劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但miR-17-92簇中其他成員miR-18a和miR-19a抑制劑卻沒(méi)有同樣的效應(yīng)。Chen等[13]應(yīng)用了RT-qPCR檢測(cè)了20例肺癌患者癌組織和鄰近區(qū)域正常組織中的miRNA-17-5p表達(dá)水平，221例肺癌患者血清和54名健康者血清miRNA-17-5p表達(dá)水平。結(jié)果顯示肺癌組織中miR-17-5p表達(dá)升高，并且，與健康者相比，患者血清miR-17-5p表達(dá)水平亦顯著升高；生存分析顯示，血清miR-17-5p表達(dá)越高，生存時(shí)間越短。血清miR-17-5p表達(dá)水平可能是潛在的肺癌預(yù)后標(biāo)志。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics促進(jìn)miR-17-5p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1及GLC-82體外增殖能力明顯增強(qiáng)，同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor抑制miR-17-5p表達(dá)后，細(xì)胞株的體外增殖能力顯著下降，組間差異有顯著性。隨后的Trallswell小室實(shí)驗(yàn)及Boyden小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力，均發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-17-5p mimics后，細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移及侵襲能力得到提升，轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor后，轉(zhuǎn)移及侵襲能力顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染了miR-17-5p mimic后，細(xì)胞周期蛋白CCND1及EMT相關(guān)標(biāo)志物N-CA、Vimentin表達(dá)上調(diào)；而轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor可以下調(diào)該組蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果表明miR-17-5p可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549、SPCA-1及GLC-82體外增殖能力和轉(zhuǎn)移侵襲能力，同時(shí)，miR-17-5p與CCND 1、N-CA、Vimentin的表達(dá)相關(guān)。

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[收稿日期：2015-06-03][本文編輯：李筱蕾]論著

文章編號(hào)：1674-4136(2015)05-0282-05

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2015.05.003

通訊作者：王峻，女，主任醫(yī)師，研究方向：常見(jiàn)惡性腫瘤的早期診斷、化療、熱療、細(xì)胞免疫治療、癌痛的規(guī)范化診治、晚期腫瘤的姑息治療及舒緩治療，E-mail：madamwangjun@163.com

基金項(xiàng)目：作者單位： 210024江蘇南京，江蘇省老年醫(yī)院血液腫瘤科;第一作者： 孟麗娟，女，副主任醫(yī)師，研究方向：常見(jiàn)腫瘤的早期診斷、治療，含惡性腫瘤在內(nèi)的慢性病健康管理，E-mail：hellomlj@126.com