鐘子劭　王　靜

DNA錯(cuò)配修復(fù)基因與大腸癌相關(guān)性的研究進(jìn)展

鐘子劭王靜

【提要】DNA錯(cuò)配修復(fù)是機(jī)體內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制的一種重要形式，在防止基因突變和維持基因組穩(wěn)定性的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，錯(cuò)配修復(fù)基因功能缺失在大腸癌發(fā)生機(jī)制和診治研究中起著重要作用，本文就錯(cuò)配修復(fù)基因與大腸癌相關(guān)性的研究進(jìn)展作一綜述。

錯(cuò)配修復(fù)基因；微衛(wèi)星不穩(wěn)定；大腸癌

大腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，大腸癌在全球的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，居全世界癌癥發(fā)病率的第3位［1］。我國(guó)大腸癌發(fā)病率居所有癌癥的第三位，死亡率居第五位［2］。大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)涉及遺傳與環(huán)境等多因素參與的多階段、多基因改變的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活以及錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair，MMR）的突變等等。約85%的結(jié)腸癌由染色體不穩(wěn)定引起，約15%的結(jié)腸癌則由DNA錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）所致［3-4］。目前越來(lái)越多研究證實(shí)錯(cuò)配修復(fù)基因的失活在大腸癌的發(fā)生中起著重要作用，本文就錯(cuò)配修復(fù)基因的生物學(xué)特點(diǎn)及與大腸癌的關(guān)系做一綜述。

一、錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)

人類錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)是人體細(xì)胞中存在的一種能修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的安全保障系統(tǒng)（即MMR系統(tǒng)），它是由一系列能特異性識(shí)別、雙向切除并修復(fù)錯(cuò)配堿基的酶分子組成，錯(cuò)配修復(fù)基因能特異性地識(shí)別和修復(fù)DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配，清除由簡(jiǎn)單重復(fù)序列復(fù)制錯(cuò)誤而形成的不配對(duì)堿基，具有增強(qiáng)復(fù)制忠實(shí)性，維持基因穩(wěn)定性，降低自發(fā)突變，從而保證DNA復(fù)制高度保真性的功能。

人類MMR作用機(jī)理是：首先hMSH2與hMSH6形成的hMUtS-α二聚體，結(jié)合到非甲基化子鏈的DNA堿基錯(cuò)配區(qū)，在由hMLH1和hPMS2形成的二聚體hMUtL-α協(xié)助下，特異性地識(shí)別并修復(fù)單個(gè)錯(cuò)配，插入或缺失的堿基。hMUtS-α和hMUtL-α即可激活與MUTH蛋白有關(guān)的GATC核酸內(nèi)切酶，該酶可切除未修飾的甲基化GATC序列。依賴于hMUtS、hMUtL及DNA解旋酶的協(xié)同作用，新生鏈錯(cuò)配區(qū)的一邊被切除，整個(gè)修復(fù)反應(yīng)被啟動(dòng)。其次，hMUtS-β（hMSH2/ hMSH3蛋白二聚體）在hMUtL-α及hMUtL-β（hMLHl/hPMSl蛋白二聚體）協(xié)助下，特異性識(shí)別并修復(fù)較大片斷的插入或缺失［5-6］，這些蛋白復(fù)合物一旦檢測(cè)到堿基錯(cuò)配，就能與有關(guān)的酶配合，切除含有錯(cuò)配的DNA片段，并合成新的DNA片段以代替被切除的部分，進(jìn)而完成錯(cuò)配DNA鏈的修復(fù)過(guò)程。已發(fā)現(xiàn)人類MMR系統(tǒng)的基因中hMLHl，hMSH2，hMSH3，hMSH6，hPMSl，hPMS2與大腸癌有關(guān)的基因，目前研究最多的是hMLH1、hMSH2和hMSH6，hMLH1和hMSH2基因突變占所有檢測(cè)到的突變的90%以上［7］。MMR缺失會(huì)導(dǎo)致DNA鏈錯(cuò)配的積聚，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。

二、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）

微衛(wèi)星（Microsatellite）DNA是廣泛分布于原核和真核生物基因組中短的串聯(lián)重復(fù)序列，約占人類基因的10%，核心序列為1～6 bp。這類基因多位于基因非編碼區(qū)以及染色體的近端粒區(qū)，在人群中表現(xiàn)為高度多態(tài)性主要是由于重復(fù)序列長(zhǎng)度的數(shù)目不同，正常個(gè)體體細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中其長(zhǎng)度（或重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)）保持不變。研究表明，微衛(wèi)星DNA具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

產(chǎn)生MSI的原因可能是由于MMR基因的突變，無(wú)法糾正在遺傳復(fù)制過(guò)程中由于DNA“鏈滑”或在有絲分裂（或減數(shù)分裂）期染色體的不對(duì)稱交換造成的復(fù)制錯(cuò)誤。MMR功能缺陷的一個(gè)重要特征是MSI陽(yáng)性，與正常細(xì)胞相比，MMR缺陷的腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星序列的突變率是正常細(xì)胞的100～1 000倍。MMR基因功能缺陷時(shí)，不能及時(shí)修復(fù)DNA復(fù)制時(shí)的錯(cuò)誤，導(dǎo)致癌基因（如癌基因ras，src，e-myc，C-erbB2等）、抑癌基因（APC，p53，DCC等）及其他與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的基因發(fā)生突變累積，而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［8］。在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)MSI，研究較多的為大腸癌，其中大約95%HNPCC和15%的散發(fā)性大腸癌中MSI表達(dá)陽(yáng)性。

美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）經(jīng)廣泛討論推薦采用2個(gè)單核昔酸重復(fù)序列（BAT-25和BAT-26）和3個(gè)二核昔酸重復(fù)序列（D-17S25015、D2Sl23和D5S346）5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)作為MSI的標(biāo)準(zhǔn)，將大腸癌按微衛(wèi)星不穩(wěn)定發(fā)生頻率分為3型，在分析的5個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記中有2個(gè)或2個(gè)以上發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象稱為MSI-H；如1個(gè)發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象稱為MSI-L；如沒(méi)有發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象稱為MSS。MSI的發(fā)生與錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)缺失密切相關(guān)。MSI-H通常稱為dMMR，MSI-L、MSS稱為pMMR。2008年，Nagasaka等重新定義了MSI，要求至少有1個(gè)單核昔酸重復(fù)序列不穩(wěn)定和另外l個(gè)NCI推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中的1個(gè)不穩(wěn)定，他們認(rèn)為這樣可以降低2個(gè)二核昔酸重復(fù)序列不穩(wěn)定產(chǎn)生的假陽(yáng)性［9］。

三、錯(cuò)配修復(fù)基因突變與大腸癌

1.MSI引起結(jié)直腸癌的分子機(jī)制

MSI引發(fā)的特殊基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑突變，是導(dǎo)致大腸癌的機(jī)制之一。錯(cuò)配修復(fù)基因缺失引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定，微衛(wèi)星重復(fù)序列中30多個(gè)基因突變，如DNA修復(fù)蛋白MRE11A、hRAD50、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體Ⅱ、前凋亡因子Bax、錯(cuò)配修復(fù)蛋白MSH3和MSH6等［10］。這些基因在細(xì)胞功能及轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮多種作用，其突變的急速積聚可誘發(fā)大腸癌的發(fā)生。遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌與散發(fā)性結(jié)直腸癌dMMR發(fā)生機(jī)制不同。

2.MMR與HNPCC

HNPCC又稱Lynch綜合癥，是一種常染色體顯性遺傳疾病，占全部大腸癌的1%～5%，其特征是發(fā)病年齡輕，多小于50歲，有家族史，以右半結(jié)腸癌為主，常伴有同時(shí)和異時(shí)結(jié)腸原發(fā)癌及結(jié)腸外腫瘤。Olschwang等［11］經(jīng)分析后認(rèn)為，約70%的HNPCC綜合征都是由于MMR基因的胚系突變引起的。其中hMLHl和hMLH2基因的胚系突變是超過(guò)90%的HNPCC的致病原因（其中60%HNPCC與hMSH2突變有關(guān)，30%與hMLH1突變有關(guān)）。在HNPCC中，MMR基因突變失活的機(jī)制是一個(gè)等位基因在胚系中失活，另一個(gè)等位基因由于體細(xì)胞的雜和性缺失而失活，最終導(dǎo)致該基因功能完全喪失。基因表型是HNPCC的診斷金標(biāo)準(zhǔn)。79%～93%HNPCC為MSI表型。MSI作為HNPCC的基因標(biāo)志物作用已在臨床中得到認(rèn)可。由MMR基因變異引起的HNPCC MSI陽(yáng)性病例隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，大于50歲患者只有17%MMR基因突變引起男性大腸癌發(fā)生率為60%～70%，女性則為30%～40%［12］。該類患者雖然預(yù)后較好，5年生存率高于散發(fā)性大腸癌，但對(duì)放化療敏感較差。

3.MMR與散發(fā)性大腸癌

散發(fā)性大腸癌在全部大腸癌中的發(fā)病率占80%以上，約15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌存在MSI-H表型［13］。但與HNPCC中MSI發(fā)生的機(jī)制不同，散發(fā)性結(jié)直腸癌中，通常發(fā)病年齡超過(guò)70歲，主要是hMLH1的CpG島高甲基化表型致dMMR引起，腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄沉默［14］。MLH1沉默占MSI-H病例的95%，hMSH2、hMSH6分別占MSI-H的5%和1%［15］，表現(xiàn)為hMLH1基因的突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于hMSH2基因的突變率。與MSI-L、MSS相比，MSI-H病例有顯著特點(diǎn)，即發(fā)病年齡相對(duì)年輕、分化高、發(fā)病部位為近段結(jié)腸、分期早、不易轉(zhuǎn)移，且預(yù)后較好［16］。

MMR功能缺陷大腸癌多發(fā)生于HNPCC，還發(fā)生在少部分MSI-H散發(fā)性大腸癌，主要機(jī)制為hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致MMR缺陷。因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)、有無(wú)家族史有助于鑒別HNPCC及散發(fā)性MSI-H大腸癌。已有研究表明BRAF突變與hMLH1甲基化導(dǎo)致的DNA錯(cuò)配修復(fù)缺乏相關(guān)［14］。Domingo等［17］研究顯示，40%散發(fā)性MSI-H腫瘤中存在BRAF V600E突變，但是在111例遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌中未檢測(cè)出該突變。BRAF突變的差異可能會(huì)用于鑒別散發(fā)MMR功能缺陷結(jié)腸癌患者和HNPCC患者。

4.dMMR大腸癌有明顯的臨床病理特征

分化程度低、較少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原病灶好發(fā)于右半結(jié)腸。大量文獻(xiàn)報(bào)道，伴有dMMR的大腸癌預(yù)后較好，MSI-H結(jié)腸癌與MSS型結(jié)腸癌比較具有獨(dú)特的臨床病理學(xué)和分子生物學(xué)特征，前者預(yù)后較好，在Ⅱ期結(jié)腸癌中，未接受化療的MSIH型結(jié)腸癌患者5年生存期高于MSS型結(jié)腸癌患者［18-19］。孟文建等［20］對(duì)128例散發(fā)性直腸癌患者采用PCR技術(shù)檢測(cè)微衛(wèi)星狀態(tài)，與MSI-L和MSS腫瘤相比，大多數(shù)MSI-H腫瘤患者為女性、黏液腺癌、高分化和術(shù)前血癌胚抗原水平高。MSI-H腫瘤患者預(yù)后好于MSI-L/MSS腫瘤患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有學(xué)者研究認(rèn)為，MSI腸癌腫物較大、浸潤(rùn)較深、局部復(fù)發(fā)可能大，而遠(yuǎn)處及重要器官轉(zhuǎn)移發(fā)生率低，醫(yī)生應(yīng)該注意局部浸潤(rùn)深的遺傳或散發(fā)dMMR腸癌往往可提示患者預(yù)后［21］。dMMR是大腸癌預(yù)后良好的一項(xiàng)重要標(biāo)志，尤其是在HNPCC的預(yù)后中更明顯［22］。

四、MMR功能缺陷檢測(cè)在大腸癌預(yù)防及治療中的價(jià)值

具有大腸癌家族史的人員患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，在這些家族人員中進(jìn)行MMR基因突變或功能缺陷的篩查，有利于及時(shí)干預(yù)，降低患病的風(fēng)險(xiǎn)，早期發(fā)現(xiàn)、治療腫瘤，可望降低病死率、提高生存率。2011年美國(guó)NCCN指南推薦對(duì)考慮使用氟尿嘧啶單藥治療的Ⅱ期患者進(jìn)行MMR檢測(cè)。Ⅱ期結(jié)腸癌dMMR患者可能預(yù)后較好，單用氟尿嘧啶可能有害。對(duì)＜50歲的結(jié)腸癌患者，應(yīng)該考慮行MMR基因檢測(cè)。Ⅱ期MSIH結(jié)腸癌患者預(yù)后好，但5-FU為主的輔助化療不能使其受益。

Des Guetz等針對(duì)7項(xiàng)研究進(jìn)行meta分析認(rèn)為，對(duì)dMMR患者術(shù)后給予5-FU輔助化療不能改善患者的無(wú)復(fù)發(fā)生存率（DFS），術(shù)后5-FU輔助治療獲益人群為pMMR患者［23］。Sargent等［24］研究表明，dMMR對(duì)未進(jìn)行化療的結(jié)腸癌患者來(lái)說(shuō)是個(gè)預(yù)后良好的標(biāo)志，但dMMR大腸癌（包括HNPCC和約15%的散發(fā)性大腸癌，表現(xiàn)為MSI-H和相應(yīng)MMR蛋白免疫組織化學(xué)缺失）對(duì)以5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療無(wú)效，因此推薦對(duì)Ⅱ期和Ⅲ期的大腸癌患者進(jìn)行MMR狀態(tài)檢測(cè)，dMMR大腸癌（尤其是Ⅱ期大腸癌）不推薦接受以5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療。Zaanan等回顧性分析比較了109名接受5-FU術(shù)后輔助和124名接受FOLFOX術(shù)后輔助的Ⅲ期結(jié)腸癌患者，發(fā)現(xiàn)與5-FU術(shù)后輔助治療dMMR患者相比，F(xiàn)OLFOX術(shù)后治療可顯著改善患者的DFS，3年DFS分別為57.9%和100%［25］。隨后，Zaanan等又分析303名Ⅲ期并且術(shù)后均接受FOLFOX4輔助化療患者的MMR狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)與pMMR患者相比，dMMR患者的3年DFS更高，分別為90.5%和73.8%［26］。Bertagnolli等［27］作了同樣的研究，Ⅲ期MSI結(jié)腸癌接受伊立替康和5-FU輔助化療效果比MSS結(jié)腸癌患者好。因此采用其他藥物與5-FU進(jìn)行輔助化療時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致不同的MSI化療藥物預(yù)測(cè)價(jià)值?？傊?，MSI可作為5-FU化療藥物不敏感性的預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物，MMR檢測(cè)對(duì)大腸癌（特別是Ⅱ期大腸癌）的個(gè)體化治療有重要的指導(dǎo)意義。在5-FU基礎(chǔ)上再聯(lián)用其他化療藥物，可能會(huì)改變MSI對(duì)5-FU為基礎(chǔ)化療的無(wú)效預(yù)測(cè)，仍然需要進(jìn)一步研究［28］。

五、問(wèn)題與展望

隨著分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高，MMR的基因檢測(cè)相對(duì)簡(jiǎn)單、方便，準(zhǔn)確率高。MMR在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，對(duì)大腸癌的預(yù)防、早期診斷及治療有重要指導(dǎo)意義。但是，尚有很多問(wèn)題有待解決：①M(fèi)MR缺陷影響細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與機(jī)制目前尚不明確；②MMR系統(tǒng)與抑癌基因、癌基因之間的相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究；③對(duì)大腸癌的癌前基因的檢測(cè)尚未普及，且對(duì)大腸癌的預(yù)后沒(méi)有跟蹤檢測(cè)，因此建立完善且方便的檢測(cè)方法十分必要；④隨著對(duì)dMMR研究的深人，有可能將大腸癌分為dMMR和pMMR兩類而采取完全不同的治療策略深入研究，以便找出最適合dMMR患者的化療方案，在規(guī)范化治療的基礎(chǔ)上制定個(gè)體化治療方案。

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2014-10-01）

（本文編輯：梁衛(wèi)江）

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