馬世杰,李 坤,付朋飛,郭曉慶,高曉云,崔保安,陳紅英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬IFN-α基因在干酪乳酸桿菌中的表達及反應(yīng)活性鑒定

馬世杰,李 坤,付朋飛,郭曉慶,高曉云,崔保安,陳紅英

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

【目的】 構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達豬α-干擾素(IFN-α)成熟蛋白的重組干酪乳酸桿菌(LactobacilluscaseiCECT5276)，為將其作為口服疫苗來提高動物機體免疫力奠定基礎(chǔ)。【方法】 從質(zhì)粒pMD18-IFN-α擴增出豬IFN-α成熟蛋白基因，再將其定向克隆到干酪乳酸桿菌整合型表達載體pMJ67的lac啟動子下游，得到重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α，電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳酸桿菌。抽提干酪乳酸桿菌基因組DNA，進行PCR擴增及測序鑒定。采用半定量RT-PCR檢測豬IFN-α mRNA在干酪乳酸桿菌中的轉(zhuǎn)錄水平；采用Western blot對重組干酪乳酸桿菌菌體進行分析，檢測其表達產(chǎn)物的活性；用雙抗體夾心ELISA法確定最適的乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度。【結(jié)果】 PCR擴增獲得了501 bp的IFN-α，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α，轉(zhuǎn)化干酪乳酸桿菌后獲得了重組乳酸桿菌。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，IFN-α mRNA在誘導(dǎo)16 h時表達水平最高；Western blot分析表明，構(gòu)建的重組干酪乳酸桿菌成功表達出了相對分子質(zhì)量約19 ku的重組蛋白，其可與鼠抗豬IFN-α抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。ELISA結(jié)果表明，當(dāng)乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度達到8 g/L時，豬IFN-α成熟蛋白的表達量達到最大，為1.3 μg/L?！窘Y(jié)論】 將豬IFN-α成熟蛋白基因整合到干酪乳酸桿菌基因組中，構(gòu)建的重組乳酸桿菌能夠穩(wěn)定表達豬IFN-α成熟蛋白。

豬α-干擾素；干酪乳酸桿菌；電穿孔轉(zhuǎn)化；抗病毒

豬病毒性疾病嚴重影響著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，并造成了重大的經(jīng)濟損失，研發(fā)一種安全高效的抗病毒制劑受到越來越多的關(guān)注。豬α-干擾素(IFN-α)作為一種有效的抗病毒細胞因子，是豬體抵御病原入侵的重要早期防御系統(tǒng)的一員[1]，其對豬的流行性腹瀉、輪狀病毒腹瀉、傳染性胃腸炎等多種病毒性疾病有較強的防制作用[2-7]。湯仁樹等[8]對重組豬IFN-α的體外抗病毒活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)重組豬IFN-α在體外可有效抑制豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)等對豬腎(PK-15)細胞的致病變作用。

干酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)能夠有效調(diào)節(jié)腸道微生物之間的平衡，增強機體的免疫力和抵抗力，是最早被廣泛應(yīng)用的益生菌之一，其產(chǎn)生的非解離乳酸能夠有效地抑制腸道致病菌，尤其是大腸桿菌的生長[9]。近幾年來，已有在嚙齒類動物和豬上通過用乳酸桿菌作為載體來表達外源基因，并用表達蛋白刺激黏膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)的報道[10-12]。如果能將IFN-α基因?qū)敫衫胰樗釛U菌，使其穩(wěn)定表達并發(fā)揮抗病毒和抑菌作用，將具有潛在的臨床應(yīng)用價值。因此，本研究將豬IFN-α基因克隆到干酪乳酸桿菌整合型表達載體pMJ67的lac啟動子下游，電穿孔轉(zhuǎn)化干酪乳酸桿菌，通過紅霉素篩選，獲得穩(wěn)定表達豬IFN-α的重組干酪乳酸桿菌，為進一步開發(fā)重組乳酸桿菌口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株 pMJ67載體購自Biomedical公司；pMD18-IFN-α質(zhì)粒由河南省動物源性食品安全重點實驗室構(gòu)建并保存。干酪乳酸桿菌CECT5276由河南省動物源性食品安全重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ，T4連接酶、DNA聚合酶，均購自鄭州奧瑞吉生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自北京康為科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Thermo公司；高純總RNA快速提取試劑盒(Tril-離心柱型)購自上海捷瑞生物工程有限公司；動物組織基因組DNA小量制備試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生物工程(大連)有限公司；豬IFN-α單克隆抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗購自中山金橋公司；豬IFN-α ELISA試劑盒購自北京嘉美有限公司(含豬IFN-α蛋白標準品)；MRS培養(yǎng)基購自英國Oxoid公司。

1.2 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中發(fā)表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank登錄號AY776246)，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計1對引物，用于擴增豬IFN-α基因(501 bp)。引物由上海生物工程有限公司合成。

IFN-α上游引物：5′-GTCGGTACCTGTGACCTGCCTCAGACC-3′，下劃線部分為KpnⅠ酶切位點；IFN-α下游引物：5′-GGCGAATTCTCACTCCTTCTTCCTGAG -3′，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點。

1.3 豬IFN-α基因的PCR擴增

以質(zhì)粒pMD18-IFN-α為模板，PCR擴增IFN-α。反應(yīng)體系為25 μL：質(zhì)粒pMD18-IFN-α 1 μL(20 ng/μL)，上、下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，ddH2O 11 μL，TaqDNA酶12 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。用水作為模板設(shè)立陰性對照。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳。參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，純化回收特異性DNA條帶。

1.4 重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α的構(gòu)建

用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切回收、純化的PCR產(chǎn)物，克隆到同樣處理的整合型表達載體pMJ67的lac啟動子下游，獲得重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α。將pMJ67-IFN-α轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒pMJ67-IFN-α，進行PCR擴增鑒定(并用水作為模板設(shè)立陰性對照)及KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切、EcoRⅠ 酶切鑒定，并將其送上海生物工程有限公司測序，用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行序列分析。

1.5 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化與鑒定

將100 μL 干酪乳酸桿菌感受態(tài)細胞與500～700 ng的重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α(體積不超過10 μL)在冰浴條件下混勻，加入到冰預(yù)冷的0.1 cm電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置10 min。使用Bio-Rad公司電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)(電壓800 V)；電轉(zhuǎn)后迅速加入1 mL含有100 g/L蔗糖的MRS培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，37 ℃孵育3 h。取電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物100 μL涂抹在含5 μg/mL紅霉素的MRS平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h。

挑取菌落在含5 μg/mL紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，取1.0 mL菌液12 000 r/min離心1 min，棄上清，用0.5 mL滅菌的去離子水懸浮，利用動物組織基因組DNA小量制備試劑盒提取干酪乳酸桿菌基因組DNA。然后利用豬IFN-α特異性引物按1.3節(jié)中擴增條件進行PCR擴增，用水作為模板設(shè)立陰性對照，對PCR產(chǎn)物進行測序。

1.6 重組干酪乳酸桿菌中豬IFN-α mRNA的轉(zhuǎn)錄

1.6.1 內(nèi)參基因16S rRNA引物的設(shè)計與合成 參照GenBank中發(fā)表的干酪乳酸桿菌16S rRNA基因序列(GenBank登錄號：NR_075032.1)，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計1對特異檢測引物(16S F:5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′；16S R:5′-CACCGCTACACATGGAG-3′)，預(yù)期擴增片段長度為341 bp。

1.6.2 半定量RT-PCR檢測豬IFN-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 用高純總RNA快速提取試劑盒提取重組豬IFN-α干酪乳酸桿菌總RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用豬IFN-α特異引物，以合成的cDNA為模板，按1.3節(jié)中的條件擴增豬IFN-α 基因。PCR擴增干酪乳酸桿菌 16S rRNA基因，反應(yīng)體系為25 μL：16S rRNA cDNA 1 μL(50 ng/μL)，上、下游引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，ddH2O 11 μL，TaqDNA酶12 μL。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min后置4 ℃保存。從擴增的豬IFN-α 基因和干酪乳酸桿菌 16S rRNA基因產(chǎn)物中分別取4 μL進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用Grab-It成像系統(tǒng)成相并分析各條帶的灰度值，以豬IFN-α基因?qū)?nèi)參基因(16S rRNA)的灰度值記錄結(jié)果。

1.7 重組干酪乳酸桿菌中IFN-α的誘導(dǎo)表達及活性檢測

將4 mL含質(zhì)粒pMJ67-IFN-α的重組乳酸桿菌接種至100 mL MRS培養(yǎng)基中，加入乳糖至終質(zhì)量濃度為8 g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，同時設(shè)立含質(zhì)粒pMJ67的重組乳酸桿菌為對照組。采用Western blot 法對重組干酪乳酸桿菌菌體進行分析。取菌液12 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入10 mL PBS懸浮沉淀進行超聲破碎(100×10 s，275 W)。將破碎后的菌體與5×上樣緩沖液混合，沸水中煮10 min，于80 V電壓下進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳25 min，然后調(diào)電壓至120 V電泳90 min。將分離膠和相同大小的浸泡過的硝酸纖維膜放入轉(zhuǎn)印槽中，用半干法轉(zhuǎn)膜，15 V轉(zhuǎn)膜50 min。將膜浸入封閉液(TBST+50 g/L脫脂奶粉)，緩慢振蕩1 h；TBST洗3次，每次5 min，將膜放入平皿中，加入豬IFN-α單克隆抗體，4 ℃過夜；TBST洗3次，將膜放入平皿中，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG二抗，孵育2 h；TBST洗3次，在DAB顯色液中顯色。

1.8 乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的確定

采用雙抗體夾心ELISA法確定乳糖的最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度。選擇質(zhì)量濃度依次為0，0.125，0.25，0.5，1和2 μg/L的豬IFN-α蛋白標準品做標準曲線，試驗重復(fù)3次。將含質(zhì)粒pMJ67-IFN-α的重組乳酸桿菌和未重組的干酪乳酸桿菌分別接種至MRS培養(yǎng)基中，加入乳糖至終質(zhì)量濃度分別為0，5，8和10 g/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。取菌液12 000 r/min 離心10 min，收集菌體后，加入10 mL PBS懸浮沉淀進行超聲破碎(100×10 s，275 W)。取破碎后的菌體加樣，每孔加入100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃下作用40 min；用洗滌液充分洗板4～6次；每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL；洗板；每孔加入酶標抗體工作液100 μL，置37 ℃下作用10 min；洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)10 min；每孔加入100 μL終止液；用酶標儀讀取OD值，波長為450 nm，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬IFN-α基因的PCR擴增

利用豬IFN-α特異性引物，對質(zhì)粒pMD18-IFN-α進行PCR擴增，獲得1條約501 bp的片段(圖1)，與預(yù)期的擴增片段大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α的鑒定

2.2.1 PCR擴增及酶切鑒定 對重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α進行PCR擴增，獲得1條約501 bp的目的條帶(圖2)。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后出現(xiàn)了2條帶，其中1條帶為載體條帶(長度約為4 895 bp)，另1條為插入的目的條帶(長度約為501 bp)；經(jīng)EcoRⅠ酶切，出現(xiàn)1條長度約 5 500 bp的特異性條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2.2 序列測定及分析 所測序列全長為501 bp，為豬IFN-α成熟蛋白基因(501 bp)，其與GenBank中發(fā)表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank登錄號：AY776246)的同源性為100%，表明重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α構(gòu)建成功。

2.3 豬IFN-α基因重組干酪乳酸桿菌的鑒定

提取經(jīng)紅霉素篩選呈陽性的干酪乳酸桿菌DNA，進行PCR擴增，出現(xiàn)1條約501 bp的片段(圖3) ，與預(yù)期擴增片段長度相吻合。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，所獲序列與GenBank中發(fā)表的English LW IFN-α基因序列 (GenBank 登錄號：AY776246) 同源性為100%。結(jié)果表明IFN-α基因成功整合到干酪乳酸桿菌中。

圖3 豬IFN-α基因重組干酪乳酸桿菌的PCR鑒定結(jié)果
M.DNA Marker DL2000；1.PCR產(chǎn)物；2.陰性對照
Fig.3 PCR amplification of IFN-α gene in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276
M.DNA Marker DL2000;1.PCR products;2.Negative control

圖4 重組干酪乳酸桿菌中豬IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的半定量RT-PCR檢測結(jié)果
M.DNA Marker DL2000；1～4.乳糖誘導(dǎo)12，14，16，18 h時豬IFN-α mRNA的RT-PCR產(chǎn)物；6～9.乳糖誘導(dǎo)12，14，16，18 h 時16S rRNA的RT-PCR產(chǎn)物；5，10.陰性對照
Fig.4 RT-PCR analysis of pig IFN-α mRNA in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276
M.DNA Marker DL2000;1-4.RT-PCR products of pig IFN-α mRNA at time 12,14,16,and 18 h,respectively; 6-9.RT-PCR products of 16S rRNA at time 12,14,16, and 18 h,respectively;5,10.Negative control

2.4 RT-PCR檢測豬IFN-α mRNA含量

重組干酪乳酸桿菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后豬IFN-α mRNA表達的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。用Grab-It成像系統(tǒng)對各條帶的灰度值進行分析，結(jié)果顯示，經(jīng)7.5 g/L乳糖誘導(dǎo)12，14，16，18 h樣品的相對灰度值分別為0.54，0.63，1.74和1.71，表明豬IFN-α mRNA在誘導(dǎo)16 h時轉(zhuǎn)錄水平最高。

2.5 豬IFN-α蛋白活性的Western blot檢測

Western blot結(jié)果(圖5)顯示，含有重組質(zhì)粒pMJ67-IFN-α的重組菌體出現(xiàn)1條約為19 ku的蛋白，而只含表達質(zhì)粒pMJ67的重組菌體在19 ku處沒有條帶。結(jié)果表明，重組干酪乳酸桿菌表達的目的蛋白是豬IFN-α成熟蛋白。

圖5 重組干酪乳酸桿菌誘導(dǎo)表達豬IFN-α 的Western blot檢測結(jié)果
M．蛋白Marker；1.pMJ67轉(zhuǎn)化菌菌體；2.重組菌菌體
Fig.5 Western blot analysis of recombinant protein inLactobacilluscaseiCECT5276 with lactose induction
M.Protein Marker;1.LactobacilluscaseiCECT5276 transformed with pMJ67;2.RecombinantLactobacilluscaseiCECT5276

2.6 乳糖最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度的確定

以IFN-α標準品的質(zhì)量濃度為自變量(x)，以O(shè)D450為固變量(y)繪制標準曲線，求回歸方程，結(jié)果見圖6。

圖6 IFN-α的標準曲線
Fig.6 Standard curve of IFN-α

對不同質(zhì)量濃度乳糖誘導(dǎo)的樣品進行檢測后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度達到8 g/L時，豬IFN-α成熟蛋白的表達量達到最大，為1.3 μg/L,且重組乳酸桿菌組與干酪乳酸桿菌組差異顯著(P<0.05)(圖7)，故乳糖最佳誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為8 g/L。

3 討 論

隨著重組蛋白技術(shù)的發(fā)展完善，豬IFN-α基因的表達系統(tǒng)也有了更多的選擇。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有結(jié)構(gòu)簡單、遺傳背景清楚的特點，但其表達產(chǎn)物易形成包涵體，翻譯后加工修飾體系不完善，同時高表達時易錯誤折疊使表達產(chǎn)物無活性，導(dǎo)致作用受限。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有表達量高、可誘導(dǎo)、糖基化機制接近高等真核生物的特點，但表達的蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控。干酪乳酸桿菌作為表達和傳遞外源基因的載體系統(tǒng)，具有安全性高及通過先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)的特點[13]，尤其是一些經(jīng)過篩選的干酪乳酸桿菌可直接口服，能夠耐受胃液中的強酸和小腸上段的膽鹽，免去了目的蛋白的體外提純等后加工過程。本試驗利用的乳酸桿菌表達系統(tǒng)為干酪乳酸桿菌菌株和整合型表達載體pMJ67，使豬IFN-α基因在干酪乳酸桿菌中得到了穩(wěn)定的表達。

由于革蘭氏陽性菌有較厚的細胞壁，所以常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法不適合將外源基因轉(zhuǎn)化到乳酸桿菌中。應(yīng)用電穿孔法可在干酪乳酸桿菌、植物乳酸桿菌中獲得較高的轉(zhuǎn)化效率(每μg DNA可得106～7轉(zhuǎn)化子)，彌補了在其他菌種中電穿孔法轉(zhuǎn)化效率不高(每μg DNA可得102～3轉(zhuǎn)化子)[14]的缺陷。有學(xué)者研究了不同情況下pLHR質(zhì)粒對乳酸桿菌的轉(zhuǎn)化效率，認為影響轉(zhuǎn)化效率的因素有電壓、培養(yǎng)液中甘氨酸的濃度、細菌含量等[15]。本試驗采用的方法僅需準備高壓滅菌過的三蒸水、10%甘油、含1.2%甘氨酸的MRS培養(yǎng)液，操作方法與大腸桿菌電轉(zhuǎn)化基本相同，并成功地將豬IFN-α基因整合到干酪乳酸桿菌的基因組中。

本試驗對重組干酪乳酸桿菌中豬IFN-α的表達情況在mRNA水平和蛋白水平上進行了分析，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)豬IFN-α mRNA在誘導(dǎo)16 h時含量最高；Western blot分析表明，在乳糖誘導(dǎo)的重組干酪乳酸桿菌體內(nèi)表達出了約19 ku的目的蛋白，與豬IFN-α成熟蛋白理論分子質(zhì)量大小相符；ELISA檢測表明，豬IFN-α成熟蛋白在乳糖誘導(dǎo)質(zhì)量濃度為8 g/L時表達量最高，且表達產(chǎn)物具有較好的反應(yīng)活性，這為下一步將該菌株用于抗病毒和抑菌作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Expression and reactivity of porcine interferon-alpha inLactobacilluscasei

MA Shi-jie,LI Kun,FU Peng-fei,GUO Xiao-qing,GAO Xiao-yun,CUI Bao-an,CHEN Hong-ying

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou，Henan450002,China)

【Objective】 This study aimed to construct the recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 that could stably express porcine IFN-α to increase the immunity of animals as an oral vaccine.【Method】 Porcine IFN-α gene was amplified from plasmid pMD18-IFN-α,and then directionally cloned into the down-stream of lactose-inducible promoter of integrative vector pMJ67.The integrative plasmid pMJ67-IFN-α was transformed intoLactobacilluscaseiCECT5276 by electroporation.Genomic DNA was extracted and identified by PCR product sequencing.The transcriptional level of porcine IFN-α mRNA was detected in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 by RT-PCR.The expression product of the recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 and concentration of lactose induction were detected by Western blot and ELISA.【Result】 The recombinantLactobacilluscaseiCECT5276 (501 bp) was identified by PCR product sequencing.The highest expression level of porcine IFN-α mRNA was detected 16 hours after induction in recombinantLactobacilluscaseiCECT5276,as revealed by RT-PCR for amplification of porcine IFN-α gene.The 19 ku expressed protein of porcine IFN-α and the specificity were identified by Western blot.The optimal concentration of lactose induction of 8 g/L was tested by ELISA and the highest expression level was 1.3 μg/L.【Conclusion】 The recombinantLactobacilluscaseiwas obtained successfully.

porcine interferon-alpha;Lactobacilluscasei;electroporation;antiviral

2014-01-10

河南省重大科技專項(111100110300)

馬世杰(1987-)，男，河南新鄭人，碩士，主要從事分子免疫學(xué)和分子病毒學(xué)研究。 E-mail:participate2006@126.com

陳紅英(1965-)，女，四川仁壽人，教授，博士后，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)和分子病毒學(xué)研究。 E-mail:chhy927@163.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.028

S852.65+1

A

1671-9387(2015)07-0029-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.028.html