高效分子排阻色譜法測定注射用頭孢匹胺鈉中聚合物的含量

郭艷娟，郭福慶

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

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高效分子排阻色譜法測定注射用頭孢匹胺鈉中聚合物的含量

郭艷娟，郭福慶

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立高效分子排阻色譜法測定注射用頭孢匹胺鈉中聚合物的含量。方法：采用TSK-GEL G2000SWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm)；以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)為流動相；檢測波長231 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 ml/min；進(jìn)樣量10 μl。結(jié)果：頭孢匹胺在1.962 5～19.624 5 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=1.000 0)，最低檢出濃度0.08 μg/ml。結(jié)論：建立的方法簡單、快速、靈敏度高，可有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

注射用頭孢匹胺鈉,高分子聚合物，TSK-GEL G2000SWXL凝膠色譜柱

注射用頭孢匹胺鈉(cefpiramide sodium)近年來廣泛應(yīng)用于臨床，對革蘭陽性菌有很強(qiáng)的抗菌作用，對革蘭陰性菌在內(nèi)的細(xì)菌亦有廣譜抗菌活性。同時，對綠膿桿菌等葡萄糖非發(fā)酵革蘭陰性桿菌有很強(qiáng)的抗菌活性，本藥作用為殺菌，并對各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定。研究證實，β-內(nèi)酰胺類抗生素中的高分子聚合物是引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)的過敏原[1，2]，且藥品中高分子聚合物的含量直接影響過敏反應(yīng)的發(fā)生率。故控制產(chǎn)品中的高分子聚合物的含量，對減少此類抗生素過敏具有重要意義[3]。在傳統(tǒng)的聚合物控制中，多采用葡聚糖凝膠G10色譜柱分析。有文獻(xiàn)報道[4]，注射用頭孢匹胺鈉也采用葡聚糖凝膠柱進(jìn)行聚合物的測定，但該法專屬性差，分離效率低，靈敏度低，分析時間長。近年來多采用TSK凝膠色譜柱，即以球狀蛋白親水凝膠為填充劑的一系列新型色譜柱替代進(jìn)行聚合物的分析。相較G10色譜柱，TSK凝膠柱具有分析時間短，靈敏度高等特點。本文通過方法學(xué)驗證建立了采用TSK凝膠色譜柱測定頭孢匹胺鈉高分子聚合物的HPLC法，采用此方法對3批注射頭孢匹胺鈉進(jìn)行了檢驗，并與其他現(xiàn)有文獻(xiàn)方法進(jìn)行了比較，驗證了檢測方法的可行性。

1 儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀(美國Agilent公司)，Mettler Toledo XS 205 型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。注射用頭孢匹胺鈉(韓國某廠生產(chǎn)，規(guī)格為1.0 g，批號4001、4003、4006)。頭孢匹胺鈉對照品(韓國某廠提供，批號S14-251，純度：93.7%)、5-巰基-1-甲基四氮唑和苯甲酸鈉(韓國某廠提供)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 TSK-GEL G2000SWXL色譜柱(7.8 mm×300 mm)，流動相采用磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)，流速為0.8 ml/min，檢測波長為231 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μl。照分子排阻色譜法(《中國藥典》2010年版二部附錄Ⅴ H)測定。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液 取注射用頭孢匹胺鈉適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋成每1 ml中約含頭孢匹胺1.0 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液 取頭孢匹胺對照品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含100 μg的溶液，精密量取5 ml置50 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2.3 定位溶液 取5-巰基-1-甲基四氮唑10 mg，置100 ml量瓶，加甲醇1 ml使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml置10 ml量瓶，用水稀釋至刻度，作為定位溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取5-巰基-1-甲基四氮唑10 mg，置100 ml量瓶，加甲醇1 ml使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml置10 ml量瓶，加“2.2.1”項下供試品溶液稀釋至刻度，搖勻，取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，5-巰基-1-甲基四氮唑峰與其前相鄰雜質(zhì)峰的分離度為3.3(應(yīng)大于1.5)，見圖1。另精密量取對照溶液5 ml置200 ml量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液，取靈敏度測試溶液10 μl注入液相色譜儀，主成分峰高的信噪比為15(應(yīng)大于10)。

2.4 專屬性試驗

2.4.1 酸破壞 取“2.2.1”項下供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L的鹽酸溶液1 ml，水浴加熱1 min后，放置至室溫，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml，搖勻。

1.5-巰基-1-甲基四氮唑 2.苯甲酸鈉 3.頭孢匹胺鈉

2.4.2 堿破壞 取“2.2.1”項下供試品溶液10 ml，加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml，室溫放置3 min后，加0.1 mol/L鹽酸溶液1 ml，搖勻。

2.4.3 氧化破壞 取“2.2.1”項下供試品溶液10 ml，加1%的過氧化氫溶液1 ml，室溫放置4 min。

2.4.4 加熱破壞 取“2.2.1”項下供試品溶液10 ml，置100 ℃水浴加熱1 min后，放置至室溫。

2.4.5 光照破壞 取“2.2.1”項下供試品溶液10 ml，置254 nm紫外燈下光照30 min。

取酸、堿、氧化、加熱和光照破壞后的溶液，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖2。聚合物峰間、聚合物峰與其他雜質(zhì)峰間均能良好分離，方法專屬性好。

2.5 線性關(guān)系考查 取頭孢匹胺鈉對照品26.18 mg置250 ml量瓶，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照儲備液，分別取上述對照儲備液1、2、4、5、6、8和10 ml置50 ml量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，依法測定。結(jié)果表明：對照溶液濃度在1.962 5～19.624 5 μg/ml范圍內(nèi)，溶液濃度與測得的峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=31.688X+0.597 6(r=1.000 0)。

2.6 樣品取樣量與聚合物測定結(jié)果的相關(guān)性考查 取4006批注射用頭孢匹胺鈉樣品約60、120和180 mg，分別置3個100 ml量瓶中，依法測定，計算保留時間小于5-巰基-1-甲基四氮唑峰的各雜質(zhì)峰面積的和，結(jié)果表明，供試品取樣量在62.97～184.97 mg范圍內(nèi)，取樣量與聚合物峰面積總和呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y=2.794 3X+4.990 5(r=1.000 0)。

2.7 最低檢出限 經(jīng)試驗測試最低檢測濃度為0.08 μg/ml，其峰高為噪音的3倍，計算最低檢測限為0.008%。

2.8 重復(fù)性試驗 取4006批注射用頭孢匹胺鈉樣品，照“2.2.1”項下方法配制6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算保留時間小于5-巰基-1-甲基四氮唑峰的各雜質(zhì)峰面積的和，結(jié)果的RSD為1.4%，表明重復(fù)性良好。

1.頭孢匹胺鈉

2.9 穩(wěn)定性試驗 取4006批樣品制成供試品溶液分別于4 ℃條件下放置23 min及1、2、3、4、5、6、7和8 h后進(jìn)樣測試，計算保留時間小于5-巰基-1-甲基四氮唑峰的各雜質(zhì)峰面積的和，結(jié)果表明，雜質(zhì)總和隨放置時間的延長逐漸增加，見表1，因此供試品溶液配制好后應(yīng)于低溫保存并盡快進(jìn)樣分析。

2.10 樣品測定結(jié)果 取注射用頭孢匹胺鈉4001、4003和4006批樣品，依法測定，計算保留時間小于5-巰基-1-甲基四氮唑峰的各雜質(zhì)峰面積的和，總雜質(zhì)結(jié)果分別為0.96%、0.94%和0.91%。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 討論

3.1 流動相的選擇 通過以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.005 mol/L磷酸氫二鈉-0.005 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(95:5)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.005 mol/L磷酸氫二鈉-0.005 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)為流動相進(jìn)行比較試驗，結(jié)果以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)為流動相時，分離效果最好，故選用磷酸鹽緩沖液(pH7.0)[0.01 mol/L磷酸氫二鈉-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液(61∶39)]-乙腈(97.5∶2.5)為流動相。

3.2 波長的選擇 以231 nm波長測定結(jié)果各雜質(zhì)峰的響應(yīng)值均高于以254 nm波長測定，靈敏度高，故選用231 nm波長測定。

3.3 不同方法的比較 采用TSK凝膠色譜柱進(jìn)行分析時，主峰前出現(xiàn)的雜質(zhì)峰中除聚合物峰外，也可能存在其他非聚合物的雜質(zhì)峰，本文通過用已知雜質(zhì)對照品在相同色譜條件下進(jìn)樣發(fā)現(xiàn)，主峰前保留時間12.145 min的峰為5-巰基-1-甲基四氮唑(為頭孢匹胺的主要降解雜質(zhì))，保留時間12.687 min的峰為苯甲酸鈉(輔料峰)，故計算聚合物含量時應(yīng)將這兩個峰去除。否則，會造成測定結(jié)果偏高。相關(guān)文獻(xiàn)[5]未將主峰前非聚合物的雜質(zhì)峰去除，故造成測定結(jié)果遠(yuǎn)高于采用傳統(tǒng)葡聚糖凝膠色譜柱的相關(guān)文獻(xiàn)[4]。采用本文方法只計算保留時間小于5-巰基-1-甲基四氮唑峰的各雜質(zhì)峰面積的和采用傳統(tǒng)葡聚糖凝膠色譜柱的相關(guān)文獻(xiàn)[4]方法測定4001批樣品結(jié)果分別為0.96%和0.94%，基本一致。

綜上所述，本法比其他文獻(xiàn)方法更能準(zhǔn)確、客觀、快速、有效的測定注射用頭孢匹胺鈉中聚合物的含量。

1 鄧增潮. 關(guān)于頭孢菌素類藥物用藥前做皮試的探討[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2005，21(11)：1449

2 蔡姍英, 胡昌勤. β-內(nèi)酸胺類抗生素中高分子聚合物的分離分析方法研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2002，18(2)：138-142

3 袁雯瑋. 高分子聚合物研究與中國藥典2005年版β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子聚合物修訂情況及操作要點[J].中國抗生素雜志，2005，30(12)： 727-730

4 汪梅，朱美榮. 注射用頭孢匹胺鈉中頭孢匹胺聚合物的測定[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志, 2007, 30(12): 727

5 徐明琴，陳林，張靜霞，等. HPSEC法測定注射用頭孢匹胺鈉中聚合物的含量[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊, 2014, 35(3): 131-133

Determination of polymers in cefpiramide sodium for injection by HPSEC

Guo Yanjuan，Guo fuqing

(Tianjin institute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective： To establish an HPSEC method for determination of the polymer in cefpiramide sodium for injection. Method： The analysis was carried out using a TSK-GEL G2000SWXLchromatographic column (7.8 mm×300 mm) with the mobile phase containing 97.5% of acetonitrile and 2.5% of 0.01 mol/L phosphate buffer solution [containing 0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate and 0.01 mol/L sodium dihydrogen phosphate(61∶39),pH 7.0]. The detective wavelength was set at 231 nm and the temperature of the column at 30 ℃.The flow rate was 0.8 ml/min with 10 μl of the sample to be injected into the HPLC. Results： The linear range of cefpiramide sodium was 1.9625～19.6245 μg/ml(r=1.000 0)，and LOD was 0.08 μg/ml. Conclusion： The method is simple and selective for controlling the quality of the product effectively.

cefpiramide sodium for injection，polymer，TSK-GEL G2000SWXLcolumn

2014-11-18

R927.2

A

1006-5687(2015)02-0021-04