3種方法評估肺炎克雷伯菌及鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的體外藥敏結(jié)果分析

余 倩，胡志東，李 靜，李妍淳，李 金

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，天津 300052）

論著

3種方法評估肺炎克雷伯菌及鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的體外藥敏結(jié)果分析

余 倩，胡志東，李 靜，李妍淳，李 金

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，天津 300052）

目的：比較3種藥敏方法在判定菌株對替加環(huán)素不敏感結(jié)果的一致性。方法：收集Vitek 2 Compact系統(tǒng)測定的對替加環(huán)素不敏感菌株110株，其中肺炎克雷伯菌59株，鮑曼不動桿菌51株。紙片擴(kuò)散法及MIC Test Strip(MTS)法進(jìn)行復(fù)核檢測對替加環(huán)素的敏感性。結(jié)果：以MTS法為參考方法，Vitek 2法檢測菌株與MTS法的一致率，MTS法采用EUCAST折點(diǎn)優(yōu)于FDA折點(diǎn)，并且誤差率較FDA折點(diǎn)低。Vitek2法檢測肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素敏感性與MTS法的一致率高于紙片法，而檢測鮑曼不動桿菌的一致率低于紙片法。產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率高于非產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌，Vitek 2 MIC50較MTS MIC50高一個(gè)稀釋度。CRAB對替加環(huán)素的敏感率為100%（MTS法/FDA折點(diǎn)），CSAB的中介率為77.8%，未發(fā)現(xiàn)耐藥株。結(jié)論：Vitek 2法與紙片法均不能作為檢測肺炎克雷伯菌與鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感性的常規(guī)方法，應(yīng)采用MTS法或肉湯稀釋法對不敏感菌株進(jìn)行復(fù)核。

替加環(huán)素；肺炎克雷伯菌；鮑曼不動桿菌；微生物敏感性實(shí)驗(yàn)；體外

替加環(huán)素是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的新型甘氨酰環(huán)類抗生素，是米諾環(huán)素的衍生物。替加環(huán)素通過與細(xì)菌30S核糖體亞基結(jié)合，阻止蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)菌繁殖，不受多種耐藥機(jī)制的影響，能有效地治療臨床上多種復(fù)雜耐藥細(xì)菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古霉素腸球菌（VRE）、耐碳青霉烯腸桿菌（CRE）及泛耐藥鮑曼不動桿菌（XDRAB）等。替加環(huán)素不同于氨基糖苷類、多粘菌素類藥物，其劑量小腎毒性低，治療相對安全，是治

療效果較好的廣譜抗生素。目前我國采用的美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)中尚無替加環(huán)素體外藥敏檢測的操作指南和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，并且不同的體外實(shí)驗(yàn)方法對評估替加環(huán)素敏感性差異較大，而臨床需要依據(jù)藥敏結(jié)果確定患者的用藥治療，為此，我們探討用3種常用方法評價(jià)、比較其體外藥敏對臨床的用藥指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年2月-2015年1月經(jīng)Vitek 2 Compact系統(tǒng)測定對替加環(huán)素不敏感菌株110株，其中肺炎克雷伯菌59株，標(biāo)本分離自痰標(biāo)本36株、尿液12株、血液2株，其他9株；鮑曼不動桿菌51株，標(biāo)本分離自痰標(biāo)本37株、肺泡灌洗液8株、其他6株。剔除同一患者重復(fù)標(biāo)本。

1.2 儀器和試劑 Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀及配套藥敏卡AST-GN16（法國梅里埃公司）、水解酪蛋白試劑（杭州天和微生物公司）、替加環(huán)素藥敏紙片（15 μg）及替加環(huán)素MIC Test Strip試條（0.016～256 mg/L）（意大利Liofilchem公司）。

1.3 方法 經(jīng)Vitek 2 Compact測定的對替加環(huán)素不敏感菌株再行紙片法和MTS條檢測。紙片法及MTS法參照美國CLSI文件要求操作。使用新鮮配制的培養(yǎng)基，并以大腸埃烯菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923對MH培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控菌株結(jié)果在規(guī)定的范圍內(nèi)才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并注意避光培養(yǎng)。

1.4 結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn) 由于CLSI標(biāo)準(zhǔn)中尚無替加環(huán)素體外藥敏檢測的操作指南和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，因此參照美國食品藥品監(jiān)督局（FDA）、歐洲藥敏實(shí)驗(yàn)委員會(EUCAST)及張冀霞推薦折點(diǎn)[1]對結(jié)果進(jìn)行判讀（表1）。將MTS法作為參考方法比較Vitek 2法、紙片擴(kuò)散法與MTS方法的一致性。分類一致性（categorical agreement，CA）定義為被評估方法與MTS法藥敏結(jié)果判斷為一致的菌株百分比。非常重大誤差（very major error，VME）定義為被評估方法將耐藥誤判為敏感，重大誤差（major error，ME）定義為被評估方法將敏感誤判為耐藥；小誤差（minor error，mE）定義為被評估方法將中介報(bào)告為耐藥或敏感?？山邮艿恼`差范圍為：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%[2]。

表1 紙片法與MTS法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Disk diffusion and MTS interpretive criteria

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)對每種方法不同結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)得到的敏感、中介、耐藥菌株數(shù)進(jìn)行比較，并對不同方法采用同一標(biāo)準(zhǔn)得到的敏感、中介、耐藥菌株數(shù)比較。

2 結(jié)果

2.1 3種方法測定不同菌株的藥敏結(jié)果。

2.1.1 Vitek 2法在FDA標(biāo)準(zhǔn)下檢測到肺炎克雷伯菌的耐藥率71.2%，中介率28.8%，MIC50和MIC90均為8 mg/L；鮑曼不動桿菌的耐藥率7.8%，中介率92.8%，MIC50和MIC90均為4 mg/L。Vitek 2法檢測到肺炎克雷伯菌的耐藥率較高，而鮑曼不動桿菌的中介率較高，肺炎克雷伯菌的MIC50/MIC90（8 mg/L）較鮑曼不動桿菌MIC50/MIC90（4 mg/L）高一個(gè)稀釋度。

2.1.2 紙片法在檢測兩種菌對替加環(huán)素的敏感率時(shí)，按FDA推薦折點(diǎn)、EUCAST推薦折點(diǎn)、張冀霞推薦折點(diǎn)檢測到肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的敏感率分別為22%/98%、25.4%/4%、72.9%/100%。張冀霞推薦折點(diǎn)在檢測肺炎克雷伯菌的敏感率較高（72.9%），EUCAST折點(diǎn)在檢測鮑曼不動桿菌的敏感率最低（4%）。

2.1.3 MTS法的檢測結(jié)果按FDA和EUCAST折點(diǎn)判定。敏感率分別為：肺炎克雷伯菌39%/17%；鮑曼不動桿菌86.3%/56.9%，兩種判定折點(diǎn)結(jié)果的差異性較大。

2.1.4 χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，同一方法不同結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)的敏感性檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），而同一標(biāo)準(zhǔn)不同方法檢測肺炎克雷伯菌敏感性結(jié)果的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），檢測鮑曼不動桿菌，紙片法與MTS法按EUCAST判定折點(diǎn)，檢測結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．01）。

2.2 Vitek 2法、紙片法與MTS法檢測結(jié)果一致性比較 見表2。

2.2.1 Vitek 2法與MTS法結(jié)果一致性比較 MTS按FDA判定標(biāo)準(zhǔn)，Vitek 2法檢測肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌與MTS法的CA分別為23.7%和13.7%，一致率較低；而以EUCAST折點(diǎn)判定，CA分別為72.9%和27.5%，肺炎克雷伯菌的分類一致率得到了明顯提高，但仍低于90%，未產(chǎn)生極重要誤差。Vitek 2法檢測細(xì)菌對替加環(huán)素的敏感性時(shí)，肺炎克雷伯菌誤差率高于鮑曼不動桿菌。

2.2.2 紙片法與MTS法結(jié)果一致性比較 紙片法采用FDA折點(diǎn)時(shí)，菌株對替加環(huán)素的敏感性與MTS法一致率最高，誤差率較低，優(yōu)于EUCAST折點(diǎn)。

2.2.3 Vitek 2法與紙片法檢測兩種菌結(jié)果的比較 檢測肺炎克雷伯菌時(shí)，紙片法與MTS最高的一致率不及Vitek 2與MTS法的一致率高。而檢測鮑曼不動桿菌時(shí)，紙片法與MTS法的一致率明顯高于Vitek 2法與MTS法的一致率。

2.3 耐藥菌株對替加環(huán)素的敏感性 見表3。

表2 Vitek 2法、紙片擴(kuò)散法與MTS法檢測結(jié)果比較（%）Tab 2 CA,and types of errors occurred when testing tigecycline susceptibility by Vitek2 and disk diffusion as compared to MTS(%)

表3 3種方法在檢測耐藥菌株與敏感菌株的結(jié)果比較（%）Tab 3 Susceptibilities to tigecycline in resistant and sensitivity strains by three different susceptibility testing methods(%)

2.3.1 產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌（ESBL+KP）與非產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌(ESBL-KP)對替加環(huán)素的敏感性比較 ESBL+KP與ESBL-KP 3種方法檢測結(jié)果的差異不大。ESBL+KP與ESBL-KP采用Vitek 2法和MTS法的MIC50和MIC90值一致，但ESBL+KP較ESBL-KP對替加環(huán)素的敏感率低，紙片法結(jié)果為17.2%/26.6%，MTS法結(jié)果為34.5%/43.3%。

2.3.2 碳青霉烯耐藥鮑曼不動桿菌（CRAB）與敏感鮑曼不動桿菌（CSAB）對替加環(huán)素的敏感性（FDA折點(diǎn)） 將51株鮑曼不動桿菌按是否對碳青酶烯抗生素耐藥分為42株CRAB和9株CSAB，CRAB經(jīng)Vitek 2檢測到有4株對替加環(huán)素耐藥，而經(jīng)紙片法和MTS法未檢出不敏感菌株。9株CSAB經(jīng)Vitek 2檢測到9株中介，經(jīng)MTS法復(fù)核測定其中7株中介（FDA折點(diǎn)），另2株為敏感菌株分別與Vitek2法相差8個(gè)和4個(gè)稀釋度。

3 討論

肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染重要的致病菌，近些年由于出現(xiàn)了產(chǎn)碳青霉烯水解酶的肺炎克雷伯菌和泛耐藥鮑曼不動桿菌，給治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。替加環(huán)素是一種新上市的廣譜抗生素，它能有效地治療碳青霉烯耐藥菌株及多種復(fù)雜耐藥菌株，然而近些年卻出現(xiàn)了對替加環(huán)素不敏感菌株，甚至在一些沒有使用替加環(huán)素的地區(qū)也出現(xiàn)了耐藥[3]。儀器法、紙片擴(kuò)散法、E-test法、MTS法、瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法是替加環(huán)素體外藥敏實(shí)驗(yàn)方法，由于儀器法、紙片擴(kuò)散法的便捷、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，常常作為微生物實(shí)驗(yàn)室的主要方法。肉湯稀釋法是體外檢測替加環(huán)素敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)，常被用來作為參考方法評估其他可選擇藥敏方法的準(zhǔn)確性[4]。研究顯示MTS法測定替加環(huán)素MIC結(jié)果比微量肉湯稀釋法低1個(gè)稀釋度以上，但其與微量肉湯稀釋法一致性較好[5]。王輝等[6]專家共識建議當(dāng)紙片法和儀器法顯示中介或耐藥時(shí)，應(yīng)使用肉湯稀釋法或MTS法確證。因此將MTS法作為參考方法，比較Vitek 2和紙片擴(kuò)散法在測定替加環(huán)素時(shí)與MTS法的一致性。

Vitek 2由于其自動化、高通量，廣泛應(yīng)用于微生物實(shí)驗(yàn)室。Vitek 2法檢測肺炎克雷伯菌時(shí)與MTS法的最高一致率高于紙片法，而檢測鮑曼不動桿菌時(shí)低于紙片法，與何翠娥[7]的研究結(jié)果相似。Zarkotou[8]的研究顯示Vitek 2測定的替加環(huán)素MIC值較微量肉湯稀釋法高1～3個(gè)稀釋度，較MTS法高2～4個(gè)稀釋度。從表3可以看出，Vitek 2較MTS法MIC值高1～4個(gè)稀釋度，假中介及假耐藥率較高，是MTS法按EUCAST折點(diǎn)與Vitek 2法的一致率高于FDA折點(diǎn)的原因。雖然Vitek 2沒有產(chǎn)生極重要誤差，但其與MTS法的一致性較差，不能用來測定肺炎克雷伯菌及鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的MIC值，但可在常規(guī)工作中用來測定革蘭陽性菌（如MRSA、VRE）、大腸埃希菌敏感性[9-10]。

紙片法操作簡便、價(jià)格便宜是基層醫(yī)院檢測替加環(huán)素敏感性的主要方法，結(jié)果表明紙片法參照FDA標(biāo)準(zhǔn)與MTS法的一致率高于EUCAST判定折點(diǎn)和張冀霞推薦折點(diǎn)，并且mE也較另外兩種判定標(biāo)準(zhǔn)低，未產(chǎn)生ME及VME。但是無論采用哪種推薦折點(diǎn)，其CA均＜90%，因此紙片法可能不適合。

替加環(huán)素是治療多重耐藥菌株的有效藥物。ESBL+KP和ESBL-KP的敏感率分別為17.2%/ 26.6%（紙片法）、34.5%/43.3%（MTS法），ESBL+KP對替加環(huán)素的敏感率低于ESBL-KP，與Sader[11]研究結(jié)果一致。紙片法可能低估了對替加環(huán)素敏感性。Vitek 2不能用來作為測定CRAB的常規(guī)方法，CSAB是否可以使用Vitek 2法有待進(jìn)一步研究。替加環(huán)素對碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌的敏感性較好，臨床可用其治療復(fù)雜性腹腔感染、復(fù)雜性皮膚軟組織感染、社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎。

臨床上檢測替加環(huán)素的體外活性的方法很多，培養(yǎng)基配制時(shí)間、錳的含量、易氧化使結(jié)果的準(zhǔn)確性往往受到影響[1]。目前CLSI沒有替加環(huán)素的藥敏折點(diǎn)，并且不同的藥敏方法結(jié)果差異較大，肉湯稀釋法作為金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜難以在全國微生物實(shí)驗(yàn)室全面開展，因此當(dāng)紙片法和儀器法顯示中介或耐藥時(shí)，應(yīng)使用肉湯稀釋法或MTS法確證。

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（2015－06－01收稿）

Effect of Tigecycline on Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumanaii by susecptibility testing in vitro

YU Qian，HU Zhi-dong，LI Jing，LI Yan-chun，LI Jin
（Department of Laboratory Medicine，General Hospital,Tianjin Medical University，Tianjin 300052,China）

Objective：To compare Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumanaii in vitro susceptibility to tigecycline by three different susceptibility testing methods.Methods：Fifty nine isolates of Klebsiella pneumoniae and 51 isolates of Acinetobacter baumanaii,nonsusceptibility to tigecycline by Vitek 2 were collected from February 2014 to January 2015,and then were confirmed by disk diffusion method and MIC Test Strip(MTS).Results：Compared with MTS method which was on the basis of EUCAST interpretive criteria, the CA of Vitek 2 was higher than FDA for Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumanaii,and the error was lower.Vitek 2 produced higher CA result for Klebsiella pneumoniae than disk diffusion,but the CA result for Acinetobacter baumanaii was the opposite.The resistance rate of ESBL-producing K.pneumoniae isolates was higher than non-ESBL-producing K.pneumoniae,and Vitek 2 result in MIC50in 1 dilution was higher compared with MTS.Remarkably high tigecycline susceptibility rates (100%)were found among the Carbapenem-resistant A.baumanaii by MTS method,the intermediate rate of Carbapenem-susceptible A.baumanaii to tigecycline was 77.8%,and no resistant strain to tigecycline was found.Conclusion：For routine susceptibility testing of K.pneumoniae and A.baumannii on tigecycline,the disk method and Vitek2 may not be proper because of the poor correlation of results between the MTS.

tigecycline；Klebsiella pneumoniae；Acinetobacter baumanaii；microbial sensitivity tests；in vitro

R446.5

A

1006－8147（2015）06-0510-04

余倩（1989-），女，碩士在讀，研究方向：細(xì)菌耐藥機(jī)制；通信作者：胡志東，E-mail:huzhidong27@163.com。