袁 晴，杜 雪，袁碧波，屈 野，周 園，石 慧

（1．天津醫(yī)科大學總醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300052；2.武警后勤學院病原生物與免疫學教研室，天津300309；3.中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，干細胞醫(yī)學中心，天津300020）

論著

貼壁法和密度梯度離心法分離經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞的比較研究

袁 晴1，杜 雪1，袁碧波1，屈 野2，周 園3，石 慧3

（1．天津醫(yī)科大學總醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300052；2.武警后勤學院病原生物與免疫學教研室，天津300309；3.中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院血液病醫(yī)院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，干細胞醫(yī)學中心，天津300020）

目的：比較貼壁法和密度梯度離心法對經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞（MB-MSCs）的分離效果。方法：選擇25～35歲月經(jīng)周期正常的健康女性的月經(jīng)血，分別采用貼壁法和密度梯度離心法分離MB-MSCs并進行傳代。鏡下觀察原代細胞形態(tài)變化；對比原代及第2、3代細胞傳代時間；流式細胞儀檢測表面標志物；阿爾辛蘭染色檢測其成軟骨能力。結(jié)果：貼壁法分離的原代細胞呈聚集樣生長，密度梯度離心法分離的原代細胞6 d后也呈聚集樣生長。貼壁法分離原代細胞的傳代時間（14.58±1.31）d明顯快于密度梯度離心法（19.17±1.34）d，差異有顯著意義（P<0.05）；第2、3代細胞的傳代時間兩種分離方法差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。經(jīng)流式細胞儀檢測，兩種方法分離的MB-MSCs陽性表面標志物CD44、CD29、CD105、CD73含量和陰性表面標志物CD31、CD45含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），兩種方法分離的第3代細胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后比較無顯著差別。結(jié)論：采用貼壁法與密度梯度離心法分離MB-MSCs效果相似，但貼壁法更適用于早期快速獲得純度較高的細胞。

間充質(zhì)干細胞；子宮內(nèi)膜；經(jīng)血；貼壁法；密度梯度離心法

目前，干細胞在組織工程、細胞工程領(lǐng)域潛在應(yīng)用價值越來越受到人們重視，迄今，已從成年人的骨髓、胚胎、臍血、外周血[1-4]等中發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細胞。2007年，Meng等[5]從健康女性的月經(jīng)血中分離出干細胞，這是一種新型的干細胞稱為經(jīng)血源性間充質(zhì)干細胞（menstrual blood mesenchymal stem cells，MB-MSCs）。與其他干細胞相比，該干細胞不但具有高度增殖、自我更新及多向分化潛能，還具有來源廣、含量豐富、取材方便、安全無創(chuàng)等優(yōu)勢，而且不存在倫理、免疫排斥[6]問題，因此能夠進一步完善相關(guān)MB-MSCs體外分離方法，具有重大意義。目前用于間充質(zhì)干細胞分離的方法主要有4種：細胞貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠法。由于流式細胞儀法、免疫磁珠法操作繁瑣，成本高，且對細胞活性影響大，較少采用這兩種方法。而分離培養(yǎng)MB-MSCs方法據(jù)有關(guān)文獻報道只有密度梯度離心法，本研究旨在應(yīng)用貼壁法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)MB-MSCs，并對兩種方法的分離效果進行比較，以此建立一套穩(wěn)定有效、重復(fù)性好的MB-MSCs體外分離、培養(yǎng)、擴增和成軟骨誘導(dǎo)分化的方法，為經(jīng)血組織工程的種子細胞的獲取奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 月經(jīng)杯購自中國廣州美帆樂橡膠制品有限公司；1.073 g/L Ficoll液、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、TGFβ-3購自美國SIGMA公司；DMEM/12培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液購自美國GIBCO公司；抗人CD45 PITC、CD31 PE、CD44 APC-CY7、CD29 APC、CD105 PERCP-CY55、CD73 PE抗體購自美國BD公司；FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 MB-MSCs分離及培養(yǎng) 選擇25～35歲月經(jīng)周期正常的健康女性的月經(jīng)血，共3名，均已排除乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病等疾病。捐贈者在參與實驗之前被賦予一個月經(jīng)杯，徹底消毒后，置入陰道內(nèi)，在月經(jīng)初期量最多的時候，收集月經(jīng)血約10 mL，將收集到的月經(jīng)血轉(zhuǎn)移至含體積分數(shù)為1%的青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液中（經(jīng)血-PBS），4℃條件下保存，在24 h內(nèi)轉(zhuǎn)運至實驗室。采用以下兩種方法分離培養(yǎng)MB-MSCs。

1.2 ．1 貼壁法分離MB-MSCs 將經(jīng)血-PBS混合液轉(zhuǎn)移至dish培養(yǎng)皿，吸取經(jīng)血-PBS混合液至離心管，棄掉子宮內(nèi)膜組織，加入含10%FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基至體積為16 mL，混勻，取半量經(jīng)血-DMEM/F12混合液接種于4個六孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔約2 mL，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)。次日換液，以后每2～3 d更換培養(yǎng)基，逐步棄去未貼壁細胞。細胞長至80%融合，傳代。

1.2.2 密度梯度離心法分離培養(yǎng)MB-MSCs 取另一半月經(jīng)血-DMEM/12混合液，轉(zhuǎn)移至4個離心管內(nèi)每管約2 mL，混合液與PBS等體積混勻，將稀釋后的月經(jīng)血緩慢疊加于相同體積的Ficoll分離液上，2 000 r/min離心30 min后，小心吸取中間白膜層的單個核細胞，加入2倍體積PBS緩沖液，1 200 r/min，10 min洗滌2次，棄上清液，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基2 mL重懸細胞，接種于5個六孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)。次日換液，以后每2～3d換液，細胞長至80%融合，傳代。

1.3 檢測指標

1.3.1 細胞形態(tài)學觀察 觀察兩種方法分離的原代細胞的形狀、輪廓，貼壁情況和集落生長狀況。

1.3.2 細胞傳代時間 取兩種方法分離的原代及第2、3代細胞進行培養(yǎng)，觀察其傳代時間并進行比較。每孔加入0.25%胰酶1 mL消化，待細胞皺縮、體積逐漸變小，終止消化并吹打細胞，1 200r/min離心5 min后，棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度以5×105個/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，標記為P1，按1∶2比例進行傳代。每2～3 d換液。重復(fù)上述步驟進行P2、P3代的傳代培養(yǎng)。

1.3.3 表面標志物檢測 取兩種方法分離的生長良好的第3代MB-MSCs，至80%～90%融合后,予0.25%胰酶消化，1 200 r/min離心10 min，棄上清，PBS漂洗2遍；再用PBS重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×106個/mL，予待測的樣本中各加CD45 PITC、CD31PE、CD44APC-CY7、CD29APC、CD105 PERCP-CY55、CD73 PE抗體1μL,同時用PBS作為空白對照?；靹?，室溫避光孵育30 min；PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min后，加入PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測細胞表面標志物。

1.3.4 MB-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化 取兩種方法分離生長良好的第3代細胞接種至6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)過夜，貼壁后加入含10%FBS的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含1×10-8mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、100 mmol/L維生素C、10 ng/mLtgf β-3）培養(yǎng)。每孔3 mL，每3 d更換培養(yǎng)液，21 d后行阿爾辛蘭染色：先棄掉培養(yǎng)基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS洗2遍，每孔加2 mL阿爾辛蘭染色液，室溫避光染色過夜，PBS洗1遍，在顯微鏡下觀察并照像。陽性細胞漿染為藍色，觀察細胞漿是否染色及染色程度。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察 全月經(jīng)血在接種24 h后可見部分貼壁的圓形細胞、梭形細胞以及大量懸浮細胞，首次換液后，可見貼壁的MB-MSCs細胞形態(tài)呈紡錘形、梭形、多角形、成纖維細胞樣,細胞體積較小,部分細胞重疊交織集落樣生長（圖1a）；增殖速度快，細胞形態(tài)大體一致,培養(yǎng)4 d后，成簇生長的細胞形成明顯的克隆，細胞從克隆中央呈放射樣向四周排列生長，集落之間相互靠近（圖1b）；原代培養(yǎng)約14 d可達到80%～90%融合，但雜細胞很多（圖1c）。密度梯度離心法培養(yǎng)的原代細胞，第一天即貼壁，呈單個、散在分布于培養(yǎng)皿底，細胞呈長梭形，貼壁培養(yǎng)后無明顯懸浮細胞（圖1d）；6 d后單個細胞形成集落（圖1e），原代培養(yǎng)約19 d可達到80%～90%融合（圖1f），生長情況同貼壁法。

2.2 細胞傳代時間 貼壁法分離原代細胞的傳代時間明顯快于密度梯度離心法，差異有顯著意義（P<0.05），兩種分離方法第2、3代細胞的傳代時間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.3 表面標志物檢測 經(jīng)流式細胞儀檢測，貼壁法分離培養(yǎng)MB-MSCs高表達CD44、CD29、CD105、CD73，低表達CD31、CD45，見圖2。兩種方法分離的MB-MSCs陽性表面標志物CD44、CD29、CD105、 CD73和陰性表面標志物CD31、CD45含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

圖1 貼壁法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)的原代MB-MSCs的形態(tài)Fig 1 Observation of primary cells obtained by two isolation methods

表1 兩種分離方法細胞傳代時間比較Tab 1 Comparison of generation time of MB-MSCs between two isolation methods

2.4 MB-MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化 成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后1周，細胞形態(tài)由梭形變?yōu)槎嘟切危壹毎w積變大，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后阿爾辛蘭染色，胞漿呈現(xiàn)彌漫藍色，見圖3。兩種分離方法MB-MSCs染色陽性比例和染色程度基本一致。

圖2 貼壁法分離培養(yǎng)MB-MSCs的流式鑒定結(jié)果Fig 2 Results of flow cytometry of the surface markers of MB-MSCs obtained by adherence culture method

表2 兩種分離方法培養(yǎng)的MB-MSCs表面標志物含量比較Tab 2 Comparison of cell surfacial markers of MB-MSCs between two isolation methods

圖3 兩種分離方法培養(yǎng)的第3代MB-MSCs成軟骨染色觀察Fig 3 Observation of Aldrich staining by two methods

3 討論

干細胞是指在一定條件下具有無限制自我更新和增殖分化能力的一類細胞。按其存在的不同時期可分為胚胎干細胞和成體干細胞。成體干細胞是存在于各種已分化組織中的未分化細胞。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種成體干細胞的存在，如骨髓干細胞、胚胎干細胞、臍血干細胞、外周血干細胞[1-4]。1978年P(guān)rianishnikov因子宮內(nèi)膜具有周期性增殖、分化和脫落的特點而提出存在子宮內(nèi)膜干細胞的可能，又指出干細胞可能存在于子宮內(nèi)膜基底層，從而使功能層內(nèi)膜增生修復(fù)，始而往復(fù)[7]。在2008年，Meng等[5]從健康女性的月經(jīng)血中分離出干細胞，又因其來源于經(jīng)血，故稱為經(jīng)血源性間充質(zhì)干細胞。研究者也相繼證實了MB-MSCs的存在并發(fā)現(xiàn)其在特定條件下可分化為多譜系細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、成脂細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞等[8-12]。因此可被應(yīng)用于骨組織工程、軟骨修復(fù)及神經(jīng)組織工程，是組織工程研究、細胞替代治療的良好種子細胞?，F(xiàn)一些學者已證明MB-MSCs對中風有明顯修復(fù)作用[13]。與胚胎干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞相比，目前，經(jīng)血源性的間充質(zhì)干細胞研究還處于初級階段，但MBMSCs是一種新型的干細胞來源，無論是從來源、體外培養(yǎng)、倫理道德方面都有一定的優(yōu)勢。

研究發(fā)現(xiàn)，貼壁法分離的細胞經(jīng)兩次換液后，可在培養(yǎng)皿底部看見梭形的細胞。部分細胞重疊交織集落樣生長,經(jīng)多次換液后，聚集生長的長梭形細胞在瓶底形成4～6個克隆，細胞從克隆中央呈放射狀生長，集落之間相互靠近,此后增生成為形態(tài)相對均一的梭形細胞，培養(yǎng)14 d左右細胞融合可達80%以上。采用密度梯度離心法分離的貼壁細胞，散在于培養(yǎng)皿生長，以長梭形為主，細胞與細胞之間的間距較遠，培養(yǎng)后3～5 d細胞增殖緩慢，之后生長迅速，間距較近的細胞也可形成明顯的細胞集落。培養(yǎng)19 d左右，可迅速鋪滿瓶底。細胞傳代時間檢測表明：貼壁法分離原代細胞的傳代時間明顯快于密度梯度離心法，差異有統(tǒng)計學意義，而在2代以后兩者差異無統(tǒng)計學意義，表明貼壁法主要對原代細胞培養(yǎng)產(chǎn)生影響,適用于早期快速獲得純度較高的細胞培養(yǎng)方式，該法操作簡便，可以獲取純度較高的MB-MSCs，較其他方法節(jié)省費用，并可最大程度地減少污染的機會。而密度梯度離心法雖然能夠獲得純度較高的單個核細胞，但由于多次離心，可造成細胞的大量流失，且影響細胞貼壁率及生長速度。從細胞的形態(tài)來看，貼壁法和密度梯度離心法分離出來的細胞是同一類細胞，細胞形態(tài)均表現(xiàn)均一的成纖維細胞形態(tài)。

由于MB-MSCs是一個異質(zhì)細胞群，缺乏特異的表面標志物，我們采用多個表面分子對分離的細胞進行聯(lián)合鑒定。其中CD44、CD29、CD105、CD73為MB-MSCs的陽性表面標志物，CD31、CD45為MB-MSCs的陰性表面標志物。結(jié)果表明，所有細胞均符合陽性MB-MSCs的一般表型，提示兩種方法分離的細胞均為MB-MSCs。我們對實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法分離的MB-MSCs陽性表面標志物CD44、CD29、CD105、CD73和陰性表面標志物CD31、CD45含量比較，差異無統(tǒng)計學意義。研究結(jié)果提示貼壁方法和密度梯度離心方法分離經(jīng)血MB-MSCs純度相似。

多向分化潛能是判斷MSC的條件之一，目前對MB-MSCs的鑒定尚無特異性的表面標志，國際細胞治療學會間充質(zhì)及組織干細胞委員會提出的鑒定MSCs的3條最低標準，除生長特性和細胞表型外，最終判定主要通過其多向分化能力(成脂肪、成骨和成軟骨分化)來鑒定[11]。因此，我們利用MBMSCs可分化為成軟骨細胞這一特點[9]，采用阿爾辛蘭染色對成軟骨誘導(dǎo)的MB-MSCs進行了比較，檢測其細胞功能，結(jié)果表明這兩種方法分離的細胞在阿爾辛蘭染色陽性細胞基本一致。

以上結(jié)果均表明，采用貼壁法與密度梯度離心法分離MB-MSCs效果相似，但貼壁法更適用于早期快速獲得純度較高的細胞。

[1] Fridenshtein A J,Petrakova K V,Kuralesova A I,et al.Heterotopic transplants of bone marrow,analysis of precurs or cells,for osteogenic and hematotoxictissues[J].Transplantation,1968,6(2)：230

[2] Evans M J,Kaufman M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryo[J].Nature,1981,292(5819)：154

[3] Erices A,Conget P,Minguell J J.Mesenchymal progrnitor cells in humanblilical cord blood[J].Br J haematol,2000,109(1)：235

[4] Zvaifler N J,Marinova M L,Adams G,et al.Mesenchymal precursorcecells in the blood of normal lindividuals[J].Arthritis Res,2000, 2(6)：477

[5] Meng X,Ichim T E,Zhong J,et al.Endometrial regenerative cells：a novel stem cell population[J].J Transl Med,2007,5：57

[6] Zhong Z,Patel A N,Ichim T E,et al.Feasibility investigation of allogenetic endometrial regenerative cells[J].J Transl Med,2009,7：15

[7] Prianishnikov V A.On the concept of stem cell and a model of functional-morphological structure of the endometrium[J].Contraception,1978，18(3)：213

[8] Patel A N,Park E,Kuzman M,et al.Multipotent menstrual blood stromal stem cells：isolation,characterization,and differentiation[J]. Cell Transplant,2008,17(3)：303

[9] Musina R A,Belyavski A V,Tarusova O V,et al.Endometrial mesenchymal stem cells iso-lated from the menstrual blood[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(4)：539

[10]Kazemnejad S,Najafi R,Zarnani A H.Comparative effect of human platelet derivativeson proliferation and osteogenic differentiation of menstrual[J].Mol Biotechnol,2014,56(3)：223

[11]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for definin gmultipoten tmesenchyma lstroma lcells.The International Society for Cellular Therapy postion statement[J].Cytotherapy,2006,8 (4)：315

[12]Toyoda M,Cui Ch,Umezawa A.Myogenic transdiffer-entiation of menstrual blood-derived cells[J].Acta Myol,2007,12,26(3)：176

[13]Borlongan C V,Kaneko Y,Maki M,et al.Menstrual blood cells display stem cell-like phenotypic markers and exert neuroprotection following transplantation in experimental stroke[J].Stem Cells Dev, 2010,19(4)：439

（2015-04-03收稿）

Comparison of adherence culture method and density gradient centrifugation method in isolating endometrial mensenchymal stem cells isolated from menstrual blood

YUAN Qing1,DU Xue1,YUAN Bi-bo1,QU Ye2,ZHOU Yuan2,SHI Hui3
（1．Department of Obstetrics and Gynecology，General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China；2.Department of Pathogenic Biology and Immunology Logistics,College of Chinese People’s Armed Police Forces，Tianjin 300309,China;3.State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology＆Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Science＆Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China）

Objective：To compare the effects of adherence culture method and density gradient centrifugation method in isolating endometrical mensenchymal stem cells isolated from menstrual blood(MB-MSCs).Methods：MB-MSCs were obtained from healthy female volunteers aged from 25 to 35 years and isolated by adherence culture method and density gradient centrifugation method.Observation of primary cell morphology characteristics,the generation time of the primary,2nd and 3rd passage MB-MSCs were compared between two methods and the surface markers were detected by flow cytometer.In addition,chondrogenic differentiation of MSCs was examined by Aldrich staining.Results:Primary cells isolated by adherence culture method showed aggregation growth,while cells isolated by density gradient centrifugation method showed diffusion growth.The generation time of primary cells isolated by adherence culture method(14.58± 1.31)was significantly shorter than that of cells isolated by density gradient centrifugation method(19.17±1.34)days(P<0.05),while the generation time of the 2nd and 3rd passage cells showed no statistically significant differences between these methods(P>0.05).The content of positive surface markers CD44,CD29,CD105,CD73,CD44 and negative surface marker CD31,CD45 showed no significant difference between these two isolation methods(P>0.05);no significant difference at passage 3 was found by Aldrich staining in chondrogenic cells.Conclusion：MB-MSCs could be isolated by adherence culture method,and the cell isolation effects of adherence culture method are equal to that of density gradient centrifugation method.Adherence culture applies to early and rapid high purity cell culture methods.The method is simple,economical,and efficient than other methods and can reduce the chance of contamination to the lowest level.

mesenchymal stem cell;endometrial;menstrual blood；adherence culture；density gradient centrifugation method

Q813

A

1006－8147（2015）06-0525-05

國家自然科學基金資助項目（81303108）

袁晴（1989-）,女，碩士在讀，研究方向：婦科腫瘤；通信作者：袁碧波，E-mail：yuanbibotj@163.com。