牛沙門氏菌病的實驗室診斷

牛沙門氏菌病的實驗室診斷

呂學思

(黑龍江省青年農(nóng)場150050)

牛的沙門氏菌病比較嚴重，尤其是犢牛，可引起很高的發(fā)病率和死亡率。沙門氏菌病的臨床癥狀和剖檢變化沒有特異性，雖然可作為初步診斷的依據(jù)，但必須通過走患病動物進行病原菌分離或尸體剖檢做出確診。

1活菌計數(shù)

有腸炎癥狀的發(fā)病動物糞便排出大量病原菌，應(yīng)進行活菌計數(shù)而非增菌培養(yǎng)。正因如此，應(yīng)采取糞便樣品而不是棉拭子取樣，應(yīng)在使用抗生素之前采樣。從口腔分泌物和血樣中也可能分到細菌，但這些樣品的可靠性不如糞便培養(yǎng)，并且操作中必須嚴格防止污染。死于沙門氏菌病的動物組織中含有大量的沙門氏菌，脾臟、肝臟以及肝、縱膈和支氣管的淋巴結(jié)細菌數(shù)量可超過106個/g。從回腸、盲腸、結(jié)腸壁和內(nèi)容物以及相關(guān)淋巴結(jié)細菌量與此相近。樣品應(yīng)取自腸和其他內(nèi)臟器官，以區(qū)別于死于腸炎而無敗血癥的動物。流產(chǎn)動物應(yīng)采取胎兒內(nèi)容物、陰道黏液和胚胎絨毛葉樣本同樣活菌計數(shù)的結(jié)果比較可靠，因感染都柏林沙門氏菌而引起流產(chǎn)的動物的胚胎絨毛葉含菌量通常在108~1010個/g。通過細菌學檢查檢驗帶菌者比較困難，必須采取一種能區(qū)分“主動”帶菌者(持續(xù)排菌)和“被動”或“蓄伏攜帶者”(間歇排菌)的方法。在區(qū)分“主動”帶菌者方面，糞便樣品比拭子樣品更可靠一些，糞樣中沙門氏菌含量通常超過105個/g。一次分離到沙門氏菌并不能判定動物是帶菌者，只有至少3次糞樣檢測均陰性才可以判斷未感染，即便是這樣，一些“潛在攜帶者”和一些最終能清除感染但仍帶菌的動物還會被漏檢。分娩牛中采樣有一定的優(yōu)勢，但也必須小心區(qū)分“被動攜帶者”。傳統(tǒng)方法是在屠宰時從膀胱、膽汁中采樣來確定帶菌者。然而，這些樣品中并非總是含有沙門氏菌，除非同時并發(fā)肝片吸蟲病，還應(yīng)對消化道內(nèi)容物和表皮淋巴結(jié)等多個組織進行檢測。當其他組織偽陰性時，還可從瓣胃壁、皺胃壁、瘤胃壁或支氣管淋巴結(jié)、肩胛淋巴結(jié)、咽后淋巴結(jié)等處分離沙門氏菌。

2細菌培養(yǎng)

一系列增菌技術(shù)和分離培養(yǎng)基可用于沙門氏菌的培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基可選擇性促進沙門氏菌生長，而抑制雜菌生長，根據(jù)菌落形態(tài)和生化反應(yīng)對細菌進行鑒定。培養(yǎng)基的選擇取決于分離沙門氏菌的環(huán)境，常常也取決于沙門氏菌分離培養(yǎng)專業(yè)人員。通常需要有多種液體增菌培養(yǎng)基和至少兩種的固體培養(yǎng)基才能保證大多數(shù)沙門氏菌血清型的分離。增菌培養(yǎng)基能滿足沙門氏菌生長的需要，但為了抑制其他雜菌的生長，需在培養(yǎng)基中加入化學物質(zhì)、染料、抗生素和提高培養(yǎng)溫度。通常使用的培養(yǎng)基中都含有亞硒酸鈉、聯(lián)四硫酸鹽和亮綠、孔雀石綠等染料，沙門氏菌對這些物質(zhì)相對具有一定的抗性。

3細菌鑒定

在經(jīng)液體培養(yǎng)增菌后，可在固體選擇培養(yǎng)基上分離到沙門氏菌菌落，常用的選擇培養(yǎng)基有麥康凱瓊脂、亮綠瓊脂、去氧膽酸枸櫞酸瓊脂、EF-18、鉍亞硫酸鹽和沙門氏菌-志賀氏瓊脂。這些培養(yǎng)基是基于沙門氏菌對多種抗生素、膽鹽和染料具有一定的抗性，對其他雜菌有抑制作用，沙門氏菌菌落均不發(fā)酵乳糖和蔗糖，這點可與其他細菌相區(qū)別。近來有一些新技術(shù)用于沙門氏菌的診斷，包括免疫磁性分離技術(shù)(IMS)、PCR或熒光PCR技術(shù)，但這些技術(shù)目前還只限于一些研究機構(gòu)使用。一旦分離到沙門氏菌，可通過生化反應(yīng)鑒定到菌屬，有許多快速試劑盒可進行此類鑒定。可利用玻片和試管凝集試驗鑒定血清型。既然需要大量的血清型，這就需要各地實驗室的共同努力。

4血清型分類

諸如鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等重要血清型可進一步分類，常用的方法有噬菌體分型(鼠傷寒沙門氏菌有200種以上的噬菌體型，我國通常有20~30種存在，但在任何時候都只有一兩種噬菌體型占主導地位)、質(zhì)粒分析和一系列分子技術(shù)，包括核糖體分型技術(shù)(rRNA基因限制性酶切圖譜)、PFGE(脈沖場電泳)、IS200分型(與針對沙門氏菌一個獨特的插入序列(IS200)的探針雜交后比較DNA限制性酶切圖譜)、DNA指紋分析技術(shù)(RFLP：限制片段長度多態(tài)性)和AFLP(擴增片段長度多態(tài)性分析)等。